趙俊偉，華辰鳳，尚平平，謝復(fù)煒，李 翔

(中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院煙草化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450001)

砷是一種廣泛存在于自然界的微量元素，被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer，IARC)確定為I類(lèi)致癌物。煙草制品中的砷及砷化合物也被美國(guó)食品和藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)列為致癌、致癮和致呼吸毒性的物質(zhì)。人體砷的暴露途徑有多種，例如水和食物的攝取、含砷粉塵吸入等，吸煙也是一種砷的暴露途徑。研究表明，卷煙煙氣中的砷，主要以無(wú)機(jī)狀態(tài)存在，亞砷酸As(Ⅲ)是煙草中砷化合物之一。氧化應(yīng)激是體內(nèi)氧化和抗氧化失衡的一種狀態(tài)，被認(rèn)為是導(dǎo)致人體衰老和形成各種疾病的早期事件。研究顯示，卷煙煙氣中的氧化性物質(zhì)能夠誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)增加，對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA等造成損傷。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)，有助于保護(hù)細(xì)胞免受損傷。肺是卷煙煙氣接觸的主要靶器官，A549細(xì)胞源于人肺泡細(xì)胞癌，該細(xì)胞既有腫瘤細(xì)胞的特性，又有肺泡上皮細(xì)胞的表型，因此常被用于卷煙煙氣的體外毒性研究。本研究選取SOD和ROS作為亞砷酸As(Ⅲ)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)的指標(biāo)，通過(guò)檢測(cè)亞砷酸As(Ⅲ)溶液在不同染毒濃度下SOD和ROS水平的變化，分析亞砷酸As(Ⅲ)誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷，旨在為研究亞砷酸As(Ⅲ)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

A549細(xì)胞，購(gòu)于上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心；RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清，購(gòu)于美國(guó)GIBCO公司；Cu/Zn-SOD ELISA試劑盒，購(gòu)于美國(guó)Ebioscience公司。活性氧檢測(cè)試劑盒，購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；亞砷酸As(Ⅲ)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，購(gòu)于中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院。HERA Cell 240 CO細(xì)胞培養(yǎng)箱和SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)，均購(gòu)于蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SPECTRA MAX 190酶標(biāo)儀，購(gòu)于美國(guó)Molecular Devices公司；熒光/化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀，購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 A549細(xì)胞培養(yǎng)

以含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)A549細(xì)胞，置于37℃、CO體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換一次培養(yǎng)基，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用0.25%胰酶消化傳代。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，胰酶消化后，以1.5×10個(gè)/孔的濃度接種至96孔板中，于37℃、CO體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，移去培養(yǎng)基進(jìn)行染毒。分別設(shè)置空白組(含10%胎牛血清的 RPMI-1640培養(yǎng)基)、陰性對(duì)照組(A549細(xì)胞和RPMI-1640培養(yǎng)基)和染毒組[亞砷酸As(Ⅲ)溶液以砷濃度計(jì)分別為2.5、5、10、20 μg/mL，下文中關(guān)于亞砷酸As(Ⅲ)溶液的濃度均按此計(jì)]，每個(gè)劑量設(shè)6個(gè)平行孔，培養(yǎng)24 h后，加入10 μL的CCK-8，培養(yǎng)2 h后，采用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度值

D

(450)，按下式計(jì)算各濃度的細(xì)胞存活率。

進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。選擇細(xì)胞存活率超過(guò)80%的濃度，即亞砷酸As(Ⅲ)溶液的濃度分別為2.5和5 μg/mL，作為檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD濃度和細(xì)胞內(nèi)ROS含量的濃度。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD濃度檢測(cè)

將A549細(xì)胞接種于96孔板中，于37℃，CO體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，移去培養(yǎng)基，進(jìn)行染毒。分別設(shè)對(duì)照組(含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基)和暴露組[亞砷酸As(Ⅲ)溶液的濃度為2.5、5 μg/mL]，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)平行孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h。收集的細(xì)胞培養(yǎng)液樣品，按照Cu/Zn-SOD ELISA試劑盒的操作步驟檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中的SOD。即洗滌液清洗抗體包被板2次，然后每孔加入100 μL樣品，并加入辣根過(guò)氧化酶同源物稀釋劑50 μL，于室溫下密封振蕩1h；洗滌3次，每孔加入基質(zhì)溶液100 μL，室溫下避光振蕩10 min；每孔加入100 μL的終止液，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值

D

(450)。梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和對(duì)應(yīng)的吸光度值

D

(450)，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，采用回歸方程計(jì)算各組的SOD濃度。

1.2.4 細(xì)胞內(nèi)ROS含量檢測(cè)

細(xì)胞染毒和劑量選擇同1.2.3。染毒結(jié)束后，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入50μL用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的濃度為10 μmol/L的熒光探針DCFH-DA。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)20 min。無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，以去除未進(jìn)入細(xì)胞的DCFH-DA，之后每孔加入50 μL的無(wú)血清培養(yǎng)基，用熒光/化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm。以相對(duì)熒光強(qiáng)度代表細(xì)胞內(nèi)ROS含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同濃度亞砷酸As(Ⅲ)溶液處理后A549細(xì)胞存活率比較

亞砷酸As(Ⅲ)溶液對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響見(jiàn)圖1。0、2.5、5、10和20 μg/mL的亞砷酸As(Ⅲ)溶液染毒A549細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率分別為(100±10)%、(86±5)%、(81±8)%、(45±6)%和(5±1)%，總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=182.298，

P

＜0.01)，進(jìn)行兩兩比較結(jié)果顯示，亞砷酸As(Ⅲ)溶液(濃度為2.5、5、10和20 μg/mL)染毒的細(xì)胞存活率均低于對(duì)照組(

t

=2.398、3.471、11.024、22.044，均為

P

＜0.05)。隨著亞砷酸As(Ⅲ)溶液染毒劑量的升高，A549細(xì)胞的存活率呈逐漸降低的趨勢(shì)(

r

=0.99，

P

＜0.05)。A549細(xì)胞暴露于亞砷酸As(Ⅲ)溶液24 h的IC為8.8 μg/mL。

圖1 亞砷酸As(Ⅲ)溶液對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD濃度比較

亞砷酸As(Ⅲ)溶液對(duì)A549細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD濃度的影響結(jié)果見(jiàn)表1。亞砷酸As(Ⅲ)溶液的濃度為0、2.5和5 μg/mL時(shí)，A549細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD濃度的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=23.429，

P

＜0.05)；進(jìn)行兩兩比較結(jié)果顯示，亞砷酸As(Ⅲ)溶液的濃度為2.5和5 μg/mL時(shí)SOD濃度均高于對(duì)照組(

t

值分別為-4.910和-5.640，均為

P

＜0.05)，亞砷酸As(Ⅲ)溶液的濃度為5 μg/mL時(shí)SOD濃度高于劑量為2.5 μg/mL組(

t

=-3.911，

P

＜0.01)。

2.3 細(xì)胞內(nèi)ROS含量比較

亞砷酸As(Ⅲ)溶液對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)ROS含量(相對(duì)熒光強(qiáng)度)的影響結(jié)果見(jiàn)表1。與對(duì)照組比較，亞砷酸As(Ⅲ)溶液的劑量為2.5和5 μg/mL時(shí)，A549細(xì)胞內(nèi)ROS含量均較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=640.039，

P

＜0.05)；與陰性對(duì)照相比，亞砷酸As(Ⅲ)溶液的濃度為2.5和5 μg/mL時(shí)細(xì)胞內(nèi)ROS含量均高于對(duì)照組(

t

=-17.811，-58.765，均為

P

＜0.01)，亞砷酸As(Ⅲ)溶液的劑量為5 μg/mL組的細(xì)胞內(nèi)ROS含量高于劑量為2.5 μg/mL組(

t

=-15.473，

P

＜0.01)。

表1 亞砷酸As(Ⅲ)溶液對(duì)A549細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD和細(xì)胞內(nèi)ROS濃度的影響(n=4，±s)

3 討論

本研究結(jié)果顯示，一定濃度的亞砷酸As(Ⅲ)溶液能顯著降低A549細(xì)胞的存活率，且隨著染毒濃度的升高，存活率呈逐漸降低的趨勢(shì)。A549細(xì)胞暴露于亞砷酸 As(Ⅲ)溶液 24 h 的 IC為 8.8 μg/mL(約 11.76 μmol/L)。既往研究顯示，亞砷酸As(Ⅲ)溶液對(duì)人源性肝QSG7701細(xì)胞、人皮膚成纖維CCC-ESF-1細(xì)胞，人支氣管細(xì)胞和人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞等均具有體外細(xì)胞毒性，IC值分別為170.89、16.52、32和288.40 μmol/L。這些文獻(xiàn)和本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，亞砷酸As(Ⅲ)對(duì)多種臟器來(lái)源的細(xì)胞均具有體外細(xì)胞毒性，但毒性作用強(qiáng)弱存在一定差異，這可能是由于細(xì)胞種屬、實(shí)驗(yàn)條件、染毒時(shí)間和觀察方法等不盡相同所致。

ROS是細(xì)胞氧化代謝的產(chǎn)物，細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ROS生成增多，過(guò)量的ROS參與繼發(fā)性細(xì)胞氧化損傷和凋亡過(guò)程。本研究結(jié)果顯示，亞砷酸As(Ⅲ)溶液染毒A549細(xì)胞24 h后，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)，尤其是在2.5 μg/mL染毒時(shí)即可導(dǎo)致ROS增加，表明較低劑量的亞砷酸As(Ⅲ)溶液可造成細(xì)胞氧化損傷，這與王躍武等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，5 μg/mL的亞砷酸As(Ⅲ)溶液染毒細(xì)胞時(shí)，ROS相對(duì)熒光強(qiáng)度為(242.60±2.35)%，高于2.5 μg/mL的亞砷酸As(Ⅲ)溶液染毒細(xì)胞產(chǎn)生的ROS，表明亞砷酸As(Ⅲ)染毒濃度增大，細(xì)胞內(nèi)ROS增加越明顯，亞砷酸As(Ⅲ)的細(xì)胞毒性也越大，提示亞砷酸As(Ⅲ)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的氧化損傷可能是引起A549細(xì)胞毒性的原因，這有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

在本研究中，亞砷酸As(Ⅲ)溶液濃度為2.5和5 μg/mL時(shí)，A549細(xì)胞的SOD濃度均高于對(duì)照組，且5 μg/mL染毒細(xì)胞產(chǎn)生的SOD高于2.5 μg/mL組，這可能是由于在正常狀態(tài)下，SOD是維持自由基動(dòng)態(tài)平衡的重要抗氧化酶之一，但亞砷酸As(Ⅲ)染毒細(xì)胞后，破壞了細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)的平衡，為清除過(guò)多的自由基，使SOD代償性地升高。有研究顯示，亞砷酸As(Ⅲ)染毒人皮膚成纖維CCC-ESF-1細(xì)胞后，隨著染毒濃度升高，SOD表達(dá)降低，在本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)濃度范圍內(nèi)，SOD并未降低，部分原因可能是測(cè)試SOD的細(xì)胞染毒濃度的不同造成的。在該研究中用于測(cè)試SOD的最大染毒劑量的細(xì)胞存活率為(13.8±2.9)%，而本研究選取存活率超過(guò)80%的劑量進(jìn)行染毒[存活率為(81±8)%]，提示在低劑量染毒時(shí)(存活率超過(guò)80%)，SOD濃度升高，而高劑量時(shí)降低，這仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，濃度為0～20 μg/mL的亞砷酸As(Ⅲ)溶液染毒A549細(xì)胞，細(xì)胞存活率降低，且具有劑量依賴(lài)關(guān)系，表明亞砷酸As(Ⅲ)具有明顯的細(xì)胞毒性。隨著亞砷酸As(Ⅲ)溶液染毒濃度的增加，ROS和SOD濃度均升高，造成不同程度的氧化損傷，具體機(jī)制有待于進(jìn)一步深入探討。