黃立利，張夢(mèng)云，劉科亮，龐定國，劉麗達(dá)，徐培渝，

(1．四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院毒理與病理學(xué)系，四川 成都 610041；2．蘇州瑞博生物技術(shù)有限公司毒理部，北京 100085；3．四川省疾病預(yù)防與控制中心毒理所，四川 成都 610041)

2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid，2,4-D)是一種可以作為植物生長(zhǎng)抑制劑的特殊激素，因其毒性相對(duì)適中而成為應(yīng)用最廣泛的除草劑之一，被用于種植農(nóng)業(yè)、牧場(chǎng)、森林管理、花園和水生植被的控制。人和動(dòng)物接觸被這種除草劑污染的空氣、飲用水、土壤和食品可能會(huì)造成健康風(fēng)險(xiǎn)。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，大鼠暴露于100 mg/(kg·d)2,4-D可能導(dǎo)致少突膠質(zhì)細(xì)胞低髓鞘形成。72.5 mg/kg 2,4-D可干擾大鼠生殖器官的發(fā)育，產(chǎn)生生殖毒性。亞慢性低劑量2,4-D暴露改變了小鼠血漿?；鈮A水平并誘導(dǎo)腸道微生物群紊亂，影響腸道微生物群的組成和功能。已有文獻(xiàn)證實(shí)，2,4-D可通過活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生引起腎臟氧化損傷，最終導(dǎo)致器官組織的退行性和壞死改變。肝臟是積聚農(nóng)藥代謝物的主要部位，因此，作為維持葡萄糖和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)最重要的器官和相關(guān)酶產(chǎn)生的器官，肝臟可以成為2,4-D毒作用的靶點(diǎn)。目前2,4-D在動(dòng)物和人體內(nèi)的毒性機(jī)制尚不十分明確。已有的研究提示2,4-D在體內(nèi)和體外均可能會(huì)產(chǎn)生肝細(xì)胞氧化應(yīng)激。對(duì)魚肝細(xì)胞的體外研究發(fā)現(xiàn)，即使在低濃度下2,4-D也會(huì)破壞細(xì)胞能量代謝，使氧利用率下降導(dǎo)致維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的ATP供應(yīng)不足，增加氧化應(yīng)激，從而造成肝損傷；在體內(nèi)研究中也發(fā)現(xiàn)2,4-D可以抑制肝臟乳酸糖異生，同時(shí)降低細(xì)胞ATP水平，這與體外實(shí)驗(yàn)相佐證，氧化損傷可能是2,4-D造成肝毒性的途徑之一。除了機(jī)體無法代償外界化學(xué)物對(duì)細(xì)胞的損傷而導(dǎo)致細(xì)胞壞死以外，細(xì)胞的死亡還可能是由程序化的凋亡過程啟動(dòng)的。有學(xué)者進(jìn)行體外研究發(fā)現(xiàn)2,4-D可能通過破壞線粒體跨膜電位導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本研究擬用幼齡SD大鼠通過28 d重復(fù)毒性試驗(yàn)，從細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激途徑進(jìn)一步探討2,4-D致肝毒性及其機(jī)制，為2,4-D所致肝毒性的作用機(jī)制及防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)剛斷乳21 d的SD大鼠64只，體質(zhì)量60～80 g，由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[合格證號(hào)SCXK(川)2008-19號(hào)]。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后進(jìn)行試驗(yàn)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，大鼠飼養(yǎng)于屏障級(jí)動(dòng)物房[許可證號(hào)SYXK(川)2011-043號(hào)]。動(dòng)物自由飲水和攝食，動(dòng)物房溫度控制在20～24℃，相對(duì)濕度保持在55%～65%。

1.2 受試品及主要試劑

2,4-D原藥，純度98%，購自北京精華耀邦醫(yī)藥科技有限公司；丙二醛(malonaldehyde，MDA)、還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)試劑盒以及大鼠細(xì)胞色素C酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒、Caspase-3、Caspase-9活性測(cè)試盒均購自南京建成生物工程研究所；小牛血清白蛋白購于Sigma公司，考馬斯亮藍(lán)G-250購自錦江區(qū)鑫鴻瑞實(shí)驗(yàn)儀器經(jīng)營部，其余試劑均為國產(chǎn)分析純，均購自成都博奧維新試劑有限公司。

1.3 動(dòng)物分組和染毒方法

SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為4組，每組16只，雌雄各半。大鼠2,4-D經(jīng)口半數(shù)致死劑量(median lethal dose，LD)值為 375～666 mg/kg，無可見作用水平(no-observed-effect level，NOEL)為15 mg/(kg·d)。因此實(shí)驗(yàn)設(shè)2,4-D低、中、高劑量染毒組(分別為18.125、36.250、72.500 mg/kg)和 1個(gè)陰性溶劑對(duì)照組，用1%的羧甲基纖維素作為樣品溶劑，大鼠按0.01 mL/g計(jì)算灌胃體積，每天一次經(jīng)口灌胃，連續(xù)染毒28 d，染毒期間，每周稱量體質(zhì)量2次，以此來調(diào)整給藥濃度。每日觀察所有幼鼠的一般行為，大小便及中毒癥狀，記錄體質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采取股動(dòng)脈放血法將動(dòng)物處死，同時(shí)取肝臟稱量質(zhì)量，之后用天平稱取肝組織0.4 g，制作肝勻漿，離心后取上清液，用于肝臟組織中GSH、T-SOD和MDA的測(cè)定。同時(shí)取肝0.4 g并用生理鹽水清洗后，置于凍存管中，放入液氮罐中凍存，用于細(xì)胞色素C濃度、Caspase-3、Caspase-9相對(duì)活性的測(cè)定。

1.4 組織病理檢查

每只大鼠取肝臟約3 mm×4 mm，固定于40 mL(10%)的甲醛溶液中，依次經(jīng)酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋之后切片，從動(dòng)物肝左葉中部做橫切面取材，切5～8 μm厚片，之后作常規(guī)HE染色，鏡下觀察。

1.5 大鼠肝勻漿中GSH、T-SOD、MDA的測(cè)定

天平稱取肝組織0.4 g，放入手動(dòng)玻璃勻漿器中，同時(shí)加冰生理鹽水3.6 mL，將其制成肝勻漿，最后將勻漿液轉(zhuǎn)入5 mL離心管中，3 500 r/min離心10 min，取上清液，轉(zhuǎn)入到5 mL的EP管中。采用二硫二硝基苯甲酸[dithio bis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB]直接法檢測(cè)GSH活性、黃嘌呤氧化酶法測(cè)定T-SOD活性、TBA法檢測(cè)MDA濃度，測(cè)定步驟均按照試劑盒說明進(jìn)行。

1.6 大鼠肝組織中細(xì)胞色素C、Caspase-3、Caspase-9的測(cè)定

從液氮中取出凍存的肝組織，放入研缽中進(jìn)行研磨。研磨時(shí)，不斷向研缽中加入液氮，直至將組織研磨成淡粉色細(xì)粉末狀。研磨完成后稱取0.1 g轉(zhuǎn)入到1.5 mL帶蓋離心管中，加入0.9 mL PBS緩沖液，之后4℃，12 000 r/min離心15 min，取上清液。采用分光光度計(jì)在450 nm處測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品與樣品吸光度值

D

(450)，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，之后在回歸方程上計(jì)算出與之對(duì)應(yīng)的樣品中細(xì)胞色素C的濃度。在400 nm處測(cè)定樣品吸光度

D

(400)值來計(jì)算Caspase-3、Caspase-9相對(duì)活性，計(jì)算公式：

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般情況

實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠除72.500 mg/kg 2,4-D染毒組以外，活動(dòng)狀態(tài)良好，各組動(dòng)物均未出現(xiàn)死亡。與對(duì)照組比較，18.125與36.250 mg/kg 2,4-D染毒組大鼠染毒后體質(zhì)量增長(zhǎng)無明顯差異，72.500 mg/kg組大鼠于染毒第14天起，體質(zhì)量增長(zhǎng)速度明顯較對(duì)照組減緩。至染毒結(jié)束，72.500 mg/kg 2,4-D染毒組大鼠體質(zhì)量與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＜0.05)，如圖1所示。

圖1 2,4-D染毒對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響

2.2 2,4-D染毒對(duì)幼齡SD大鼠肝臟濕質(zhì)量及臟器系數(shù)的影響

與對(duì)照組比較，72.500 mg/kg 2,4-D染毒組大鼠肝臟濕質(zhì)量降低明顯，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＜0.05)，如圖2A所示；但該組大鼠的肝臟系數(shù)與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，如圖2B所示。

2.3 幼齡SD大鼠肝臟組織的病理觀察

HE染色后觀察大鼠肝組織病理學(xué)改變見圖3。與對(duì)照組比較，18.125與36.250 mg/kg 2,4-D染毒組肝組織未觀察到明顯差異(圖3B、C)，72.500 mg/kg 2,4-D染毒組大鼠部分肝組織出現(xiàn)膽管增生，并伴有炎細(xì)胞的浸潤。

2.4 2,4-D染毒對(duì)幼齡SD大鼠GSH、T-SOD、MDA的影響

大鼠肝勻漿中GSH、T-SOD、MDA的檢測(cè)結(jié)果見圖4。與陰性對(duì)照組比較，72.500 mg/kg 2,4-D染毒組肝勻漿中GSH含量、T-SOD活性明顯降低，MDA含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＜0.05)；36.250 mg/kg 2,4-D染毒組的T-SOD活性，與對(duì)照比較，也下降明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＜0.05)。

2.5 2,4-D染毒對(duì)幼齡SD大鼠細(xì)胞色素C、Caspase-3、Caspase-9的影響

大鼠肝組織中細(xì)胞色素C、Caspase-3、Caspase-9的檢測(cè)結(jié)果見圖5。與對(duì)照組比較，36.250和72.500 mg/kg 2,4-D染毒組的肝組織中細(xì)胞色素C濃度升高明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＜0.05)。與對(duì)照組比較，36.250和72.500 mg/kg 2,4-D染毒組的肝組織中Caspase-3、Caspase-9相對(duì)活性均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＜0.05)。

圖2 2,4-D染毒對(duì)大鼠肝臟濕質(zhì)量及臟器系數(shù)的影響

圖3 2,4-D染毒28 d后幼齡SD大鼠肝組織切片HE染色觀察病理學(xué)改變

圖42,4-D染毒大鼠對(duì)GSH、T-SOD、MDA的影響

3 討論

本研究結(jié)果顯示，2,4-D可影響幼齡SD大鼠的生長(zhǎng)，抑制其體質(zhì)量的增加，因此，雖然高劑量染毒組大鼠的肝臟濕質(zhì)量與對(duì)照組比較有所降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但肝臟的臟器系數(shù)與對(duì)照組比較無明顯變化，此外病理組織學(xué)也顯示僅有部分肝組織發(fā)生膽管增生，并未表現(xiàn)出明顯的病理損傷，需進(jìn)行更詳細(xì)的檢查來明確膽管增生的病理意義。

圖5 2,4-D染毒大鼠對(duì)細(xì)胞色素C、Caspase-3、Caspase-9的影響

細(xì)胞凋亡是指為了維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定，機(jī)體自發(fā)的進(jìn)行基因調(diào)控，使不需要的細(xì)胞發(fā)生程序性死亡，涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等作用。目前認(rèn)為肝細(xì)胞發(fā)生凋亡主要通過3條途徑：線粒體依賴性細(xì)胞凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和死亡受體通路途徑。Caspase-3、Caspase-9都是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)家族的重要成員。Caspase-9是細(xì)胞凋亡過程中比較上游的一個(gè)蛋白酶，當(dāng)線粒體跨膜電位在各種類型凋亡誘導(dǎo)因素的作用下降低時(shí)，線粒體內(nèi)、外膜之間的通透性轉(zhuǎn)換孔會(huì)由關(guān)閉轉(zhuǎn)換為開放，導(dǎo)致線粒體膜通透性增大，引起線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換作用(mitochondrial permeability transition，MPT)，線粒體釋放細(xì)胞色素C到胞漿中，觸發(fā)Caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)，Caspase-9與細(xì)胞色素C和Apaf1形成復(fù)合物，同時(shí)被激活，激活的Caspase-9可以進(jìn)一步激活誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生的關(guān)鍵酶Caspase-3，進(jìn)而促進(jìn)后續(xù)的細(xì)胞凋亡信號(hào)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。本次研究結(jié)果顯示，36.250 mg/kg的2,4-D即可引起Caspase-3、Caspase-9和細(xì)胞色素C釋放的增加，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＜0.05)，說明2,4-D可通過改變線粒體的通透性，釋放細(xì)胞色素C，激活Caspase-3、Caspase-9途徑，誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生凋亡。

當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)自由基代謝失衡時(shí)，則可導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生氧化損傷和細(xì)胞凋亡，同時(shí)氧化損傷又可加劇細(xì)胞凋亡的發(fā)生。近年來，越來越多的證據(jù)表明，ROS在許多慢性疾病、衰老和惡性腫瘤的發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用。農(nóng)藥暴露可通過產(chǎn)生過量ROS，如超氧陰離子、過氧化氫、羥基自由基、過氧自由基和單線態(tài)氧等，導(dǎo)致氧化應(yīng)激。ROS是細(xì)胞在正常過程中產(chǎn)生的，在正常情況下，細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)將ROS造成的損害最小化。當(dāng)ROS的產(chǎn)生增加到一定程度，超過了細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)清除能力，就會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激發(fā)生時(shí)，機(jī)體主要表現(xiàn)為ROS和抗氧化防御之間的平衡受到干擾，這一過程會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞功能的改變，并會(huì)對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和組織造成嚴(yán)重?fù)p害。肝損傷產(chǎn)生的過量自由基可廣泛損傷肝細(xì)胞，導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死、脂質(zhì)大量積蓄進(jìn)而引起脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量顯著變化。GSH和SOD是體內(nèi)重要的抗氧化劑和自由基清除劑，其可與化學(xué)毒物或其代謝產(chǎn)物相結(jié)合，減少M(fèi)DA的生成，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。因此GSH和SOD的含量可反映機(jī)體抗氧化的能力，而MDA的含量則可反映機(jī)體氧化損傷的程度。本次研究結(jié)果顯示，36.250 mg/kg的2,4-D即可引起機(jī)體MDA的生成增加，同時(shí)降低SOD、GSH的活性，表明2,4-D可引起肝臟發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，且隨著劑量的增加，作用程度加劇。

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測(cè)，2,4-D可導(dǎo)致幼齡SD大鼠肝毒性的發(fā)生，其發(fā)生的途徑可能是通過氧化損傷和細(xì)胞凋亡，但更具體的相關(guān)毒作用機(jī)制、涉及的基因表達(dá)還需進(jìn)一步研究。毒性通路是近年來的一個(gè)研究熱點(diǎn)，指常態(tài)化的細(xì)胞反應(yīng)生化通路，在被外源化學(xué)物充分?jǐn)_動(dòng)后導(dǎo)致的有害健康效應(yīng)，它涵蓋了本研究所提到的應(yīng)激反應(yīng)通路，對(duì)其進(jìn)行深入研究更有助于實(shí)施外源化學(xué)物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的預(yù)測(cè)策略，將實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行外推，保護(hù)和促進(jìn)人類健康。