趙 寧，杜健鵬，孫震曉

(1．中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院藥劑科，北京100091；2．中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院心血管科，北京 100091；3．北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 102488)

心肌缺血再灌注損傷是指在病理損傷過程中，心肌細(xì)胞在一段時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)缺血，血液恢復(fù)供應(yīng)后，出現(xiàn)較灌注之前更嚴(yán)重的損傷，如出現(xiàn)心律失常、心肌梗死面積加大等。中醫(yī)根據(jù)其病變部位及胸悶、胸痛等臨床表現(xiàn)，將該病歸屬于“胸痹”“心悸”等范疇。

鹿血為鹿科動物梅花鹿

Cervus nippon

T.或者馬鹿

C.elaphus

L.的茸血或膛血，性熱，味甘咸，歸肝腎二經(jīng)，是歷代本草均有記載的名貴中藥。最早見孫思邈的《千金·食治》，記載其“生血，治癰腫”?，F(xiàn)臨床應(yīng)用及研究多為調(diào)節(jié)免疫、治療失眠及化療后骨髓抑制等，除此之外，鹿血還有治療心悸，對心臟功能有影響，但機(jī)制尚不明確。本研究擬在細(xì)胞水平，參照Zhang等的文獻(xiàn)報(bào)道，使用無糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)造成心肌細(xì)胞缺糖損傷，部分模擬缺血再灌注體外模型，探索鹿血預(yù)處理對心肌缺血損傷的保護(hù)作用及可能的作用機(jī)制，為鹿血用于臨床治療心悸提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

出生1～3 d的SD大鼠乳鼠，雌雄不限，購于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2016-0010，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號SYXK(京)2016-0041。

1.2 試驗(yàn)藥物及試劑

鹿全血(馬鹿)由內(nèi)蒙古建元鹿業(yè)有限責(zé)任公司贊助；羊全血(綿羊)由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部提供。高糖DMEM培養(yǎng)基和Ⅳ型膠原酶購于Gibco公司；無糖DMEM培養(yǎng)基購于Invitrogen公司。胰蛋白酶購于北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司。胎牛血清購于杭州四季青生物工程有限公司。乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、丙二醛(malondial-dehyde，MDA)試劑盒，均購于南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器

本試驗(yàn)使用的主要儀器有：倒置顯微鏡TE2000-S(Nikon公司)，CO培養(yǎng)箱 MCO-18A/C(UV)(Sanyo公司)，酶標(biāo)儀Spectra Max190(美國分子儀器公司)，VD-1320型潔凈工作臺(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)，高速臺式離心機(jī)(Sigma公司)，冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

1.4 受試品處理及濃度選擇

將鹿全血在室溫下3 000 r/min離心10 min，取上清為鹿血清，冷凍干燥至粉末狀；將凍干粉末用適量高純水以近飽和濃度溶解，過濾除菌后測定蛋白質(zhì)濃度為30 mg/mL，分裝并凍存于-70°C冰箱中備用。實(shí)驗(yàn)時(shí)分別用高糖DMEM培養(yǎng)基稀釋至5、10、20 mg/mL共3個(gè)不同濃度。羊全血的處理同上。

1.5 心肌細(xì)胞培養(yǎng)

將SD大鼠乳鼠酒精消毒，用滅菌的眼科直剪于第3、4肋骨處橫剪，心臟躍出，換新眼科直剪取心尖，將取出的心尖在不含鈣和鎂的HBSS中清洗2次，之后剪成1 mm的小塊，轉(zhuǎn)移到血清瓶中，加入3 mL含有0.05%胰酶和0.1%Ⅳ型膠原酶的酶液，于37℃水浴振蕩消化，3 min后將上清棄掉，繼續(xù)加消化液，于37℃水浴振蕩消化7 min，取上清與含有血清的培養(yǎng)基混勻終止消化，重復(fù)消化至組織塊消失。于室溫1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入高糖DMEM培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清)，輕柔吹打混勻細(xì)胞接種于細(xì)胞瓶中，90 min差速貼壁后，將未貼壁的懸浮在上清液中的心肌細(xì)胞按5×10個(gè)/mL均勻接種在96孔板中，37℃、CO體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后換液，并加入終濃度為1 μmol/L的阿糖胞苷以抑制非心肌細(xì)胞生長，隔天換液。

1.6 分組及心肌細(xì)胞缺糖損傷模型的建立

心肌細(xì)胞在96孔板中常規(guī)培養(yǎng)72 h后，將致密單層、生長狀態(tài)相同的細(xì)胞隨機(jī)分為正常對照組，模型組，鹿血清低、中、高劑量組(分別為5、10、20mg/mL)，羊血清低、中、高劑量組(分別為5、10、20 mg/mL)，共8組，每組至少平行6個(gè)孔。鹿血清組及羊血清組分別加入不同濃度受試物，預(yù)處理培養(yǎng)細(xì)胞6和12 h兩種情況后，參照Zhang等制定的缺糖損傷模型方法，除正常對照組外，均以無糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)心肌細(xì)胞18 h引發(fā)缺糖損傷，取出細(xì)胞板，各組換用高糖DMEM培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h進(jìn)行復(fù)糖處理。然后進(jìn)行細(xì)胞活力和相關(guān)指標(biāo)的測定。

1.7 觀察指標(biāo)及方法

1.7.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

缺糖損傷18 h后，于倒置相差顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)，并拍照記錄。

1.7.2 MTT法檢測細(xì)胞活力

設(shè)定空白對照孔，各組細(xì)胞用PBS洗滌后，每孔加入終濃度為0.5 mg/mL的MTT溶液200 μL，37℃孵育4 h，倒掉溶液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔吸光度

D

(490)值，根據(jù)下列公式計(jì)算細(xì)胞相對活力。

1.7.3 LDH、MDA及SOD、GSH-Px活性測定

按1.6中的實(shí)驗(yàn)分組，選取加入受試物預(yù)處理12 h后，測定各組培養(yǎng)液中LDH、MDA濃度，以及SOD、GSH-Px的活性，操作均按各試劑盒的說明書進(jìn)行。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

2.1.1 心肌細(xì)胞培養(yǎng)形態(tài)學(xué)觀察

參照相關(guān)文獻(xiàn)，利用穩(wěn)定的心肌細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)條件和方法，成功培養(yǎng)了純度高、存活時(shí)間長的新生SD大鼠的心肌細(xì)胞，可用于體外實(shí)驗(yàn)研究。經(jīng)觀察培養(yǎng)3～4 d的心肌細(xì)胞存活率在90%以上，達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

經(jīng)差速貼壁法去除非心肌細(xì)胞后，分離得到的心肌細(xì)胞未貼壁時(shí)開始計(jì)時(shí)，在倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈圓形，折光性好，如圖1A。24 h后心肌細(xì)胞大部分貼壁生長，伸出偽足呈梭形、多角形，出現(xiàn)自發(fā)性搏動，如圖1B。3 d后心肌細(xì)胞逐漸形成細(xì)胞簇，可見同簇細(xì)胞同步搏動，最后心肌細(xì)胞連接成片生長，大面積同步搏動，如圖1C。

圖1 培養(yǎng)不同時(shí)間的心肌細(xì)胞形態(tài)觀察

2.1.2 無糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

利用無糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)心肌細(xì)胞18 h后的心肌細(xì)胞胞內(nèi)顆粒明顯增多，胞體收縮成一團(tuán)，搏動時(shí)快時(shí)慢，無節(jié)律，部分心肌細(xì)胞跳動不明顯，見圖2。

圖2 缺血損傷的心肌細(xì)胞和正常心肌細(xì)胞比較

2.2 鹿血清對心肌細(xì)胞缺糖損傷后活力的影響

圖3 不同濃度鹿血清預(yù)處理6 h對心肌細(xì)胞缺糖損傷后細(xì)胞活力的影響(n=3)

2.2.1 不同濃度鹿血清及羊血清預(yù)處理6 h對心肌細(xì)胞缺糖損傷后細(xì)胞活力的影響

MTT檢測結(jié)果見圖3，與正常對照組和模型組比較，不同濃度(5、10、20 mg/mL)鹿血清及羊血清組心肌細(xì)胞相對活力均增加(

P

＜0.01)；鹿血清與羊血清組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＞0.05)。

2.2.2 不同濃度鹿血清及羊血清預(yù)處理12 h對心肌細(xì)胞缺糖損傷后細(xì)胞活力的影響

MTT檢測結(jié)果見圖4，不同濃度(5、10、20 mg/mL)鹿血清組心肌細(xì)胞相對活力較模型組增加(

P

＜0.01)，不同濃度(5、10、20mg/mL)羊血清組心肌細(xì)胞相對活力與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＞0.05)；與正常對照組比較，模型組，不同濃度鹿血清組、羊血清組心肌細(xì)胞相對活力均下降(

P

＜0.05或0.01)；鹿血清與羊血清組比較，20 mg/mL鹿血清組心肌細(xì)胞相對活力高于20 mg/mL羊血清組(

P

＜0.01)。

圖4 不同濃度鹿血清預(yù)處理12 h對心肌細(xì)胞缺糖損傷后細(xì)胞活力的影響(n=3)

2.3 鹿血清預(yù)處理對心肌細(xì)胞缺糖損傷的保護(hù)作用機(jī)制研究

2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH濃度測定結(jié)果

見表1，與正常對照組比較，模型組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性比正常組高(

P

＜0.01)，說明缺糖培養(yǎng)已經(jīng)對心肌細(xì)胞造成損傷，破壞了細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)LDH泄漏。與模型組比較，不同濃度鹿血清預(yù)處理組細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH濃度均較模型組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＜0.01)。

表1 細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH濃度的測定結(jié)果(n=3)

2.3.2 MDA濃度及GSH-PX、SOD活性的測定結(jié)果

見表2，與正常對照組相比，模型組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA濃度升高(

P

＜0.05)，GSH-PX和SOD活性顯著降低(

P

＜0.01)。不同濃度鹿血清組和羊血清組MDA濃度與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＞0.05)；20 mg/mL鹿血清組，5、10、20 mg/mL羊血清組GSH-PX活力較模型組升高(

P

＜0.01)；10 mg/mL鹿血清組SOD活性較模型組升高(

P

＜0.01)。

表2GSH-PX、SOD活性及MDA濃度的測定結(jié)果(n=3)

3 討論

近年研究發(fā)現(xiàn)鹿血對離體蛙心有增強(qiáng)心肌收縮力的強(qiáng)心作用，其酒制品有提高雌性去勢大鼠的雌激素水平及抗氧化作用。為進(jìn)一步探究鹿血對心功能的作用及機(jī)制，本研究從細(xì)胞水平及分子生物學(xué)角度出發(fā)，利用原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞作為穩(wěn)定而有效的研究模型，進(jìn)行造模實(shí)驗(yàn)。對原代心肌細(xì)胞損傷造模的方法很多，常用的有利用過氧化氫、氯化鈷、異丙基腎上腺素等化學(xué)物質(zhì)對心肌細(xì)胞造成氧化、化學(xué)性缺氧缺血等損傷，還有使用無糖培養(yǎng)基和無氧環(huán)境培養(yǎng)等方法對心肌細(xì)胞造成缺血缺氧損傷。化學(xué)藥物對心肌細(xì)胞引起的損傷快速且較明顯，而鹿血作為傳統(tǒng)名貴中藥，在臨床使用過程中與其他西藥相比可能存在起效緩，作用時(shí)間長，預(yù)防作用強(qiáng)于治療作用的特點(diǎn)，綜合考慮以上原因，本實(shí)驗(yàn)選擇了利用無糖培養(yǎng)基對心肌細(xì)胞進(jìn)行缺糖損傷，部分模擬臨床心肌缺血的情況造模，研究鹿血清預(yù)處理對缺糖損傷的心肌細(xì)胞活力影響，從細(xì)胞水平揭示鹿血對心臟功能的作用。

心肌細(xì)胞損傷時(shí)會產(chǎn)生大量的自由基，其引發(fā)的氧化損傷是心肌細(xì)胞損傷的一個(gè)重要因素，是介導(dǎo)細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷和功能代謝障礙的重要途徑之一。本研究結(jié)果顯示，無糖DMEM培養(yǎng)基可以導(dǎo)致心肌細(xì)胞相對活力顯著降低，凋亡發(fā)生率升高，細(xì)胞形態(tài)學(xué)、活動功能、細(xì)胞代謝改變。經(jīng)鹿血清預(yù)處理后的心肌細(xì)胞在缺糖損傷后活力降低明顯減慢，提示鹿血清預(yù)處理可誘發(fā)顯著的心肌細(xì)胞預(yù)適應(yīng)保護(hù)作用，并且在預(yù)處理時(shí)間較長(12 h)的情況下，鹿血清比羊血清對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用更顯著。

胞漿酶自胞內(nèi)漏出至培養(yǎng)液中常作為細(xì)胞損傷的標(biāo)志，其中LDH是較為明顯和簡便的指標(biāo)，本研究中心肌細(xì)胞缺糖培養(yǎng)18 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組LDH量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常對照組。MDA是不飽和脂肪酸氧化的終產(chǎn)物，其水平的高低可反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化的程度。SOD、GSH-PX作為體內(nèi)有效的自由基清除劑，它們的催化活性對維持氧化平衡系統(tǒng)非常重要。模型組MDA含量顯著升高，說明缺糖損傷造成了脂質(zhì)氧化物的產(chǎn)生，同時(shí)GSH-PX和SOD活性顯著降低，說明無糖培養(yǎng)對心肌細(xì)胞造成了一定程度的氧化損傷。與模型組相比，鹿血清預(yù)處理組MDA含量降低，GSH-PX和SOD活性顯著升高，說明鹿血清具有提高心肌細(xì)胞內(nèi)GSH-PX和SOD活性的能力，能起到保護(hù)細(xì)胞防止脂質(zhì)過氧化和氧自由基損傷的作用。結(jié)果提示鹿血清對缺血心肌細(xì)胞的保護(hù)作用可能與其對抗氧自由基損傷及穩(wěn)定細(xì)胞膜有關(guān)，但確切的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。