陳廷玉，陳大印，沈 洪，富徐燕，盧春鳳，

(1．湖州師范學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 湖州 313000；2．佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007)

近年來(lái)，結(jié)核病發(fā)病率在全球又呈迅速回升趨勢(shì)，已成為世界性的公共衛(wèi)生問(wèn)題。在抗結(jié)核治療方案中異煙肼(isonicotinyl hydrazide，INH)是不可替代的一線抗結(jié)核藥。臨床和實(shí)驗(yàn)研究已證明INH可引起肝損傷，有時(shí)甚至發(fā)生急性肝衰竭，其明顯的肝毒性嚴(yán)重限制了它的臨床應(yīng)用。雖然有關(guān)INH肝毒性作用及其機(jī)制已有研究，但對(duì)其認(rèn)識(shí)目前仍不十分清楚，導(dǎo)致臨床在防治INH肝毒性時(shí)存在明顯盲目性，甚至出現(xiàn)了濫用保肝療法的情況。因此，闡明INH肝毒性機(jī)制，尋找合適的肝保護(hù)劑已成為抗結(jié)核治療亟需解決的問(wèn)題。

槲皮素作為一種天然黃酮類(lèi)化合物，具有抗氧化及清除自由基、調(diào)節(jié)免疫功能及抗腫瘤、抗肝纖維化、抗菌、抗血小板聚集等多種藥理作用，且易于提取，使用安全，具有理想的臨床應(yīng)用前景。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)INH可誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡及氧化損傷，并且槲皮素對(duì)其具有保護(hù)效應(yīng)，但其具體作用機(jī)制尚未闡明。因此，本研究以L-02正常人肝細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，建立INH誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷模型，以線粒體為靶點(diǎn)，以活性氧(reactive oxygen species，ROS)為切入點(diǎn)，通過(guò)應(yīng)用ROS清除劑谷胱甘肽(glutathion，GSH)后，比較槲皮素處理細(xì)胞前后INH對(duì)ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激的影響，探討ROS介導(dǎo)線粒體氧化損傷在INH肝細(xì)胞毒性中的作用及槲皮素對(duì)INH肝細(xì)胞毒性的保護(hù)效應(yīng)，為尋找有效防治INH肝毒性藥物及進(jìn)一步研究槲皮素的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑

L-02細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所；DMEM培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品；FBS為Hyclone公司產(chǎn)品；異煙肼、槲皮素、GSH(ROS清除劑)、DCFHDA、Rh-123等為Sigma公司產(chǎn)品；8-羥基脫氧鳥(niǎo)嘌呤核苷(8-hydroxydeoxyguanine nucleoside，8-OHdG)ELISA試劑盒、蛋白質(zhì)羰基含量測(cè)定試劑盒為Abcam公司產(chǎn)品；丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測(cè)試劑盒為南京建成生物工程研究所；BCA蛋白定量試劑盒為杭州碧云天公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及處理

L-02細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，將細(xì)胞隨機(jī)分為：異煙肼組，給予10 mmol/L INH；槲皮素處理組，給予10mmol/L INH和50 μmol/L槲皮素；谷胱甘肽預(yù)處理組，先用ROS清除劑GSH 20 mg/mL預(yù)處理細(xì)胞1 h，然后給予10 mmol/L INH和50 μmol/L槲皮素；谷胱甘肽組，用ROS清除劑GSH 20 mg/mL處理細(xì)胞1 h；對(duì)照組，給予等體積的無(wú)血清培養(yǎng)基。將生長(zhǎng)良好的指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按上述分組進(jìn)行處理，培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.2 熒光探針DCFH-DA檢測(cè)細(xì)胞線粒體ROS水平

細(xì)胞按上述實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行處理，收集各組細(xì)胞，采用差速離心法制備細(xì)胞線粒體。將上述各組細(xì)胞線粒體用HEPES緩沖液重懸，并吹打均勻制成線粒體懸液，加入熒光探針DCFH-DA 10 μmol/L，37℃孵育30 min，使用多功能酶標(biāo)儀，在激發(fā)波長(zhǎng)490 nm下，測(cè)定其熒光強(qiáng)度

D

(490)。ROS水平以相對(duì)值表示，即

D

(490)/

D

(490)×100%。

1.2.3 熒光探針Rho-123檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位

將上述線粒體懸液，加入Rho-123染色液，使其終濃度為5 mg/L，置于培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育20 min，冷PBS漂洗去除非特異性熒光后，使用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定其熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)490 nm)。線粒體膜電位以相對(duì)值表示，即

D(

490)/

D(

490)×100%。

1.2.4 氧化損傷指標(biāo)檢測(cè)

細(xì)胞按上述分組處理后，采用TBA比色法測(cè)定脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量；應(yīng)用DPNH比色法測(cè)定蛋白氧化損傷產(chǎn)物蛋白質(zhì)羰基的含量；采用ELISA法檢測(cè)mtDNA氧化損傷的產(chǎn)物8-OHdG含量，評(píng)價(jià)細(xì)胞線粒體氧化損傷狀態(tài)。應(yīng)用BCA法測(cè)定細(xì)胞樣品蛋白含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 槲皮素和GSH處理后L-02細(xì)胞線粒體ROS相對(duì)水平

熒光探針DCFH-DA檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。與對(duì)照組相比，INH處理細(xì)胞后細(xì)胞線粒體ROS相對(duì)水平升高(

P

＜0.01)，表明INH可誘導(dǎo)線粒體ROS的生成。與異煙肼組相比，槲皮素處理組細(xì)胞線粒體ROS相對(duì)水平降低(

P

＜0.01)，表明槲皮素可抑制細(xì)胞線粒體ROS的生成；谷胱甘肽預(yù)處理組細(xì)胞線粒體ROS相對(duì)水平低于槲皮素處理組(

P

＜0.05)，表明ROS清除劑GSH能明顯抑制INH對(duì)線粒體ROS生成的促進(jìn)作用。

圖1 L-02細(xì)胞線粒體ROS相對(duì)水平

2.2 槲皮素和GSH處理后L-02細(xì)胞線粒體膜電位相對(duì)水平

熒光探針Rho-123檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2，與對(duì)照組相比，細(xì)胞經(jīng)INH處理后線粒體膜電位降低(

P

＜0.01)，表明INH可造成線粒體損傷。槲皮素處理組細(xì)胞線粒體膜電位高于異煙肼組(

P

＜0.05)，表明槲皮素對(duì)INH誘導(dǎo)的細(xì)胞線粒體損傷有保護(hù)作用；谷胱甘肽預(yù)處理組細(xì)胞線粒體膜電位高于槲皮素處理組(

P

＜0.05)。此結(jié)果提示ROS參與INH引起的細(xì)胞線粒體損傷。

圖2 L-02細(xì)胞線粒體膜電位相對(duì)水平

2.3 槲皮素和GSH處理后L-02細(xì)胞中的MDA含量

TBA比色法檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3，與對(duì)照組相比，細(xì)胞經(jīng)INH處理后MDA含量增加(

P

＜0.01)，表明INH可誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。與異煙肼組比較，應(yīng)用槲皮素后可使MDA含量減少(

P

＜0.01)，表明槲皮素可以抑制INH誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)；谷胱甘肽預(yù)處理組MDA含量低于槲皮素處理組(

P

＜0.05)，表明給予ROS清除劑GSH能明顯抑制INH誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。此結(jié)果提示，ROS參與了INH引起的肝細(xì)胞線粒體脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。

圖3L-02細(xì)胞MDA含量

2.4 槲皮素和GSH處理后L-02細(xì)胞中的蛋白質(zhì)羰基含量

DPNH比色法檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4，與對(duì)照組比較，INH處理細(xì)胞后，可增加細(xì)胞蛋白羰基含量(

P

＜0.01)，表明INH可造成蛋白氧化損傷。與異煙肼組比較，槲皮素可使蛋白羰基含量減少(

P

＜0.01)，表明槲皮素對(duì)INH誘導(dǎo)的蛋白氧化損傷有保護(hù)作用；谷胱甘肽預(yù)處理組蛋白羰基含量低于槲皮素處理組(

P

＜0.05)，表明給予ROS清除劑GSH能明顯抑制INH誘導(dǎo)的蛋白氧化損傷。此結(jié)果提示，ROS參與INH引起的蛋白氧化損傷。

2.5 槲皮素和GSH處理后L-02細(xì)胞中的8-OHdG含量

ELISA檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5，與對(duì)照組比較，INH處理細(xì)胞后8-OHdG含量增加(

P

＜0.01)，表明INH可造成mtDNA氧化損傷。應(yīng)用槲皮素可使8-OHdG含量低于異煙肼組(

P

＜0.01)，表明槲皮素對(duì)INH誘導(dǎo)的mtDNA氧化損傷具有保護(hù)作用；谷胱甘肽預(yù)處理組8-OHdG含量低于槲皮素處理組(

P

＜0.05)，表明給予ROS清除劑GSH能明顯地抑制INH誘導(dǎo)的mtDNA氧化損傷。此結(jié)果提示，ROS參與INH引起的mtDNA氧化損傷。

圖4 L-02細(xì)胞蛋白質(zhì)羰基含量

圖5 L-02細(xì)胞8-OHdG含量

3 討論

INH對(duì)肝臟的損傷機(jī)制是多重和復(fù)雜的，確切機(jī)制至今仍不是很清楚，但普遍認(rèn)為，INH的肝毒性是由其代謝產(chǎn)物介導(dǎo)的。Ergul等研究發(fā)現(xiàn)，INH可引起肝臟氧化損傷，而抗氧化劑能夠?qū)笽NH引起的肝損傷。課題組前期研究應(yīng)用大鼠從整體動(dòng)物水平觀察了INH對(duì)大鼠肝臟的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)INH可造成大鼠肝臟氧化損傷。這些研究表明，氧化損傷在INH肝毒性中具有重要作用。INH在體內(nèi)代謝過(guò)程中通過(guò)氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生ROS，過(guò)量ROS有可能是INH產(chǎn)生肝毒性的主要因素。研究表明，ROS過(guò)多生成可損傷線粒體膜，導(dǎo)致線粒體膜電位降低。因此，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了L-02細(xì)胞線粒體ROS水平及線粒體膜電位。結(jié)果顯示，L-02細(xì)胞經(jīng)INH處理后，線粒體ROS水平升高，膜電位降低，表明INH可促進(jìn)線粒體ROS生成，造成線粒體損傷。那么INH導(dǎo)致的肝細(xì)胞損傷是否與ROS介導(dǎo)的線粒體氧化損傷有關(guān)？本研究進(jìn)一步檢測(cè)了細(xì)胞線粒體氧化損傷的重要指標(biāo)：脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA、蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物蛋白羰基、mtDNA氧化損傷產(chǎn)物8-OHdG，其含量的多少可反映細(xì)胞線粒體氧化損傷的程度。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，L-02細(xì)胞經(jīng)INH處理后，MDA、蛋白質(zhì)羰基及8-OHdG含量增加，表明在本實(shí)驗(yàn)條件下，INH可促進(jìn)線粒體ROS產(chǎn)生，導(dǎo)致線粒體氧化損傷。這與Bansal等的研究結(jié)果一致。

研究表明，槲皮素在體外可通過(guò)清除氧自由基、抑制DNA損傷等發(fā)揮抗氧化作用，有希望成為抗超氧陰離子的新藥。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，槲皮素能明顯減少L-02細(xì)胞線粒體ROS生成，并增加線粒體膜電位，表明槲皮素可抑制ROS生成，改善線粒體功能。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用槲皮素后可使MDA、蛋白羰基、8-OHdG含量減少，表明槲皮素對(duì)INH誘導(dǎo)的細(xì)胞線粒體氧化損傷具有保護(hù)效應(yīng)，其機(jī)制可能與槲皮素減少細(xì)胞線粒體ROS生成，抑制細(xì)胞線粒體氧化損傷有關(guān)。Zou等研究發(fā)現(xiàn)槲皮素具有逆轉(zhuǎn)HO引起的細(xì)胞氧化損傷和凋亡作用，其機(jī)制與抗氧化和穩(wěn)定線粒體膜，阻止促凋亡途徑有關(guān)，提示槲皮素對(duì)線粒體氧化損傷有保護(hù)作用。在其他實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ脱芯恐幸舶l(fā)現(xiàn)，槲皮素也可以通過(guò)抑制細(xì)胞線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放和ROS生成，減輕肝細(xì)胞線粒體氧化損傷。因此，我們認(rèn)為槲皮素清除細(xì)胞線粒體ROS，抑制線粒體氧化損傷可能是其抗INH肝毒性的主要機(jī)制之一。

為了明確ROS在INH誘導(dǎo)肝細(xì)胞線粒體損傷中的作用，并探討ROS介導(dǎo)的線粒體氧化損傷在槲皮素抗INH肝細(xì)胞毒性中的作用，本研究通過(guò)應(yīng)用ROS清除劑GSH清除肝細(xì)胞內(nèi)ROS，分析槲皮素處理細(xì)胞前后INH對(duì)ROS介導(dǎo)的線粒體氧化應(yīng)激的影響，以評(píng)價(jià)ROS介導(dǎo)的線粒體氧化損傷在INH肝細(xì)胞毒性及槲皮素抗INH肝細(xì)胞毒性中的作用。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)加入ROS清除劑后，細(xì)胞線粒體ROS水平、MDA、蛋白羰基、8-OHdG的含量進(jìn)一步降低，而線粒體膜電位升高。表明在INH處理細(xì)胞前給予ROS清除劑GSH能明顯抑制INH誘導(dǎo)的細(xì)胞線粒體氧化損傷，提示ROS參與了INH導(dǎo)致的肝細(xì)胞線粒體氧化損傷，證實(shí)了ROS介導(dǎo)的線粒體損傷在INH誘導(dǎo)肝細(xì)胞毒性中發(fā)揮了重要的作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用ROS清除劑后，槲皮素對(duì)INH誘導(dǎo)的線粒體氧化損傷的抑制作用更明顯，進(jìn)一步證實(shí)ROS介導(dǎo)的氧化損傷在槲皮素抗INH肝細(xì)胞毒性中發(fā)揮重要的作用。本研究結(jié)果還提示，槲皮素對(duì)INH肝細(xì)胞毒性的保護(hù)效應(yīng)除了與其能清除ROS有關(guān)外，可能還有其他的機(jī)制參與。

總之，在本實(shí)驗(yàn)條件下，INH可誘導(dǎo)L-02肝細(xì)胞線粒體發(fā)生氧化損傷，ROS介導(dǎo)的線粒體氧化損傷在INH誘導(dǎo)肝細(xì)胞毒性中發(fā)揮了重要作用；槲皮素對(duì)INH誘導(dǎo)的線粒體氧化損傷具有保護(hù)效應(yīng)，其機(jī)制可能與清除線粒體ROS，抑制ROS介導(dǎo)的線粒體氧化損傷有關(guān)。但具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步深入研究。