李柏茹 ，秦雙建，李閏冰，蔡 穎 ，鄭 凱，王冰玉，曾 明，肖 芳，，徐新云

(1．中南大學(xué)湘雅公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南 長沙410078；2．深圳市疾病預(yù)防控制中心，廣東深圳 518055；3．南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南 衡陽 421001)

《2013年全球疾病負擔(dān)研究》顯示，暴露于環(huán)境可吸入顆粒物在全球殘疾調(diào)整壽命年(disability adjusted of life years，DALYs)風(fēng)險因素中排名第12位，《2015年全球疾病負擔(dān)研究》顯示大氣細顆粒物(fine particulate matter，PM)是第5大死亡危險因素和第6大傷殘調(diào)整壽命年的危險因素，并且PM相關(guān)死亡率呈現(xiàn)逐年上升趨勢。PM是指空氣動力學(xué)當(dāng)量直徑≤2.5 μm的顆粒物，具有粒徑小、吸附有毒有害物質(zhì)、活性強等特點，可以進入人體深部呼吸道，并通過血液運輸?shù)竭_身體的各個部位，可對全身多個系統(tǒng)造成損害。國際癌癥機構(gòu)(International Agency for Research on Cancer，IARC)已將 PM列為致癌物，黃靖等在一項國家橫斷面研究中發(fā)現(xiàn)長期暴露于濃度范圍較廣的PM與慢性腎臟疾病患病率增加之間存在顯著相關(guān)性。同時國外一項流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)室外空氣污染與腎癌的發(fā)生密切相關(guān)。PM可以誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、免疫紊亂、DNA損傷和遺傳毒性、信號通路改變等對機體產(chǎn)生損傷，使得癌基因和凋亡基因表達發(fā)生改變。既往大量研究主要是開展PM對肺和支氣管的影響，本實驗室前期也重點研究了PM對人支氣管上皮細胞的影響，但關(guān)于PM對腎細胞的影響文獻報道很少，因此本文應(yīng)用HK-2腎細胞進行PM染毒，檢測癌基因(

c-myc、c-fos、p53

)和凋亡基因(

Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2

)表達的變化，為深入探討PM對HK-2腎細胞的毒理學(xué)作用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

人腎上皮細胞(HK-2)購于上海細胞庫。DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，胎牛血清(美國Gibco公司)，RNeasy Mini Kit(德國Qiagen公司)，基因反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime Scrip RT Reagen kit)和反轉(zhuǎn)錄-PCR核酸染料檢測試劑盒(SYBR Prime Script RT-PCR kit)(日本TaKaRa公司)，凋亡基因和癌基因PCR引物由上海生工合成。c-myc、c-fos、p53一抗購于美國Cell Signaling公司；Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2 和GAPDH一抗均購于美國Santa Cruz公司，二抗(羊抗兔IgG-HRP、羊抗鼠IgG-HRP)購于美國Thermo Scientific公司。中流量大氣采樣器(TH-150C III型)購于武漢市天虹儀器有限責(zé)任公司；7500實時熒光定量PCR儀購于美國Applied Biosystems公司；垂直電泳系統(tǒng)(Mini-protean Tetra)購于美國Bio-Rad公司；冷CCD成像系統(tǒng)購于美國GE公司。

1.2 PM2.5樣品制備

PM樣品采集于山西省太原市山西大學(xué)校園內(nèi)，本實驗對采集到的吸附有PM的濾膜稱質(zhì)量后剪成2 cm×2 cm小塊放于燒杯中，加入超純水完全浸沒濾膜，用錫箔紙密封，超聲振蕩30 min后取出濾膜，將PM樣品懸濁液轉(zhuǎn)移到干凈的真空冷凍物料盤中，再次用錫箔紙密封后于-80℃冰箱冷凍24 h；用封口膜替換錫箔紙密封物料盤并在封口膜上點許多密集的小孔，于真空冷凍干燥機中干燥24 h，至PM完全干燥；無菌工作臺中紫外燈滅菌2 h后用超純水溶解干燥的PM顆粒，使之混合均勻，完成PM混懸液的制備，分裝標(biāo)記后于-20℃保存待用，每次使用前振蕩混勻。

1.3 CCK-8法測定PM2.5對細胞存活率的影響

用含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基在37℃、CO體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)HK-2細胞至穩(wěn)定后消化，以每孔5×10個細胞的濃度接種到96孔板中，培養(yǎng)24 h后吸出培養(yǎng)液，利用不含血清的DMEM培養(yǎng)基配制終濃度為12.5、25.0、50.0、100.0、150.0、200.0 和 300.0 μg/mL 的 PM懸液作為實驗組，每孔加入100 μL懸液進行染毒；以不加PM的DMEM培養(yǎng)基孔作為對照組；不加PM和HK-2細胞的孔作為空白組。每組設(shè)置4個復(fù)孔，對細胞染毒培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)液。按照CCK-8試劑盒說明書向每孔加入含10%CCK-8原液的溶液100 μL，在培養(yǎng)箱孵育1～4 h后用酶標(biāo)儀測定吸光度

D

(450)值。利用公式：

計算出各濃度下細胞存活率，并求出PM對HK-2細胞的半數(shù)抑制濃度(IC)。

1.4 細胞培養(yǎng)與PM2.5染毒分組

利用DMEM培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細胞濃度為4×10個/mL并接種至6孔板中，每孔加2 mL培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)，待細胞覆蓋率達到80%時進行PM樣品染毒。本研究設(shè)置了只添加DMEM培養(yǎng)基的陰性對照組、終濃度分別為10和50 μg/mL的低和高劑量PM染毒組、終濃度為10 μmol/l Cr陽性對照組。每組細胞染毒后均培養(yǎng)24 h，染毒結(jié)束后應(yīng)用實時熒光定量PCR(quantitative real-time，PCR，qPCR)和Western blot分別檢測c-myc、c-fos、p53、Caspase-8、Caspase-9和Bcl-2 mRNA和蛋白的表達水平。

1.5 qPCR檢測目的基因mRNA表達水平

將染毒后的HK-2細胞用PBS清洗3次，使用RNeasy Mini Kit提取各個劑量組細胞的總RNA，按基因反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系：5×Prime Script RT Master Mix液 4 μL，總 RNA 1 μg，加 RNase Free dHO 至 20 μL。反轉(zhuǎn)錄條件：37℃、15 min，85℃、5 s，4℃、10 min，-20℃冰箱保存。將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板進行PCR擴增，對目的基因mRNA水平進行定量檢測。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，55℃退火延伸30 s，共40個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，運用2公式計算目的基因的相對表達水平。目的基因PCR引物序列見表1。

表1 目的基因qPCR引物序列

1.6 Western blot檢測蛋白表達水平

將染毒后的HK-2細胞用PBS清洗3次，加入適量含蛋白酶抑制劑的裂解液于冰床上裂解細胞20 min，收集細胞混懸液于EP管中，在4℃、10 000 r/min條件下離心20 min，收集上清液，按照BCA蛋白濃度定量法對收集的蛋白樣品進行定量。加入5×上樣緩沖液，100℃變性8 min。配制10%分離膠，5%濃縮膠，按照定性結(jié)果進行蛋白上樣。SDS-PAGE凝膠電泳后，使用濕轉(zhuǎn)法電泳90 min將蛋白完全轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，在TBST稀釋成的5%脫脂牛奶中于室溫搖床上封閉2 h，根據(jù)目的蛋白分子大小切取相應(yīng)條帶之后使用一抗于4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，加入相應(yīng)的二抗，于室溫搖床上孵育50～60 min，隨后TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑后使用冷CCD成像系統(tǒng)進行顯影，以GAPDH作為內(nèi)參，使用Image J軟件分析灰度值并計算蛋白相對表達水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PM2.5樣品對HK-2細胞的IC50

結(jié)果顯示，當(dāng)PM染毒終濃度為25.0 μg/mL時HK-2細胞存活率明顯下降，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

＜0.01)，利用GraphPad Prism軟件計算得到PM混懸液染毒24 h對HK-2細胞的IC為95.98 μg/mL，見圖1。

圖1 PM2.5染毒24 h后對HK-2細胞活力的影響

2.2 PM2.5對癌基因和凋亡基因mRNA表達的影響

qPCR結(jié)果顯示，與陰性對照組(100%)比較，10、50 μg/mL PM染毒組和陽性對照(10 μmol/L的Cr)組HK-2細胞c-myc mRNA表達分別升高了106.52%、85.53%和102.83%；c-fos mRNA表達分別升高32.16%、42.28%和27.35%；p53 mRNA表達分別下降7.77%、25.07%和35.26%；Caspase-8 mRNA表達分別升高16.98%、24.05%和26.27%；Caspase-9 mRNA表達分別升高59.73%、65.90%和121.43%；Bcl-2mRNA表達分別下降40.09%、49.76%和69.73%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

＜0.01)，見表2。

2.3 PM2.5對目的蛋白表達水平的影響

Western blot結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，10、50 μg/mL PM染毒組和陽性對照(10 μmol/l的Cr)組HK-2細胞c-myc蛋白表達水平分別升高了7.64%、29.67%和24.80%，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

＜0.05)；c-fos蛋白表達水平分別升高了2.54%、18.44%和32.07%，除10 μg/mL PM染毒組外，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

＜0.05)；p53蛋白表達水平分別下降了16.69%、20.40%和19.63%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

＜0.05)；Caspase-8蛋白表達水平分別升高了16.90%、28.95%和28.30%，除10 μg/mL PM染毒組外，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

＜0.05)；Caspase-9蛋白表達水平分別升高11.78%、27.54%和50.78%，除10μg/mL PM染毒組外，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

＜0.05)；Bcl-2蛋白表達水平分別下降了13.19%、9.47%和16.37%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

＜0.05)，見圖2和3。

表2 PM2.5染毒后HK-2細胞癌基因和凋亡基因mRNA表達水平

圖2 PM2.5染毒對HK-2細胞c-myc、c-fos和p53蛋白表達水平的影響

圖3 PM2.5染毒對HK-2細胞Caspase-8、Caspase-9和Bcl-2蛋白表達水平的影響

3 討論

PM由于其粒徑小的特點可以吸附鉛、鎘、砷、鉻等重金屬和多環(huán)芳香烴類有機污染物，到達人的深部呼吸道從而進入血液危害人體健康。以上物質(zhì)大部分具有致突變和致癌作用，對身體健康產(chǎn)生重大影響，但是目前關(guān)于PM對腎臟損傷的研究只有流行病學(xué)研究，缺少有關(guān)機制方面的研究。本實驗室前期開展PM成分檢測分析，太原市PM中存在一定濃度的 Pb、As、Cd、Ni、Cr、Mn、Al等重金屬和多種PAHs，因此本文開展PM致HK-2腎細胞中部分癌基因和凋亡基因表達變化的研究，以初步探索PM對腎臟的損害機制。

c-fos

基因是一種可以對各類外界刺激在數(shù)分鐘內(nèi)做出反應(yīng)的原癌基因，其功能是通過調(diào)節(jié)特定靶基因的方式將細胞表面被刺激的短程信號與細胞長期反應(yīng)相耦連。目前許多研究認為

c-fos

基因與細胞增殖、分化及凋亡有關(guān)，在乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌等惡性腫瘤中均能檢測到過表達的c-fos。Ishida等用c-Fos/AP-1的選擇性抑制劑T-5224處理小鼠后發(fā)現(xiàn)，LPS注射后血清中的TNF-α和HMGB-1水平降低，血清中BUN和肌酐濃度也降低，并提高了生存率，說明抑制c-Fos/AP-1可減輕LPS誘導(dǎo)的腎臟病理變化，可見

c-fos

基因在LPS致腎損傷的過程中起著一定的作用，也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)經(jīng)過PM染毒后的大鼠肺組織和后代鼠海馬組織中的

c-fos

基因表達水平升高，這與本實驗中得到PM染毒后HK-2細胞中

c-fos

基因表達升高的結(jié)果一致。

c-myc

是1977年被發(fā)現(xiàn)的一種具有惡性轉(zhuǎn)化作用的癌基因，其表達的cmyc蛋白是一種涉及細胞分化、生長、增殖以及凋亡的轉(zhuǎn)錄因子，并且參與調(diào)節(jié)人類15%的基因。有研究發(fā)現(xiàn)c-myc參與多囊腎的發(fā)生和發(fā)展，c-myc也可以通過負調(diào)節(jié)c-FLIP并增強FasL/Fas介導(dǎo)的凋亡途徑導(dǎo)致促進缺血再灌注腎損傷中腎小管細胞凋亡，同時c-myc可以通過使正常細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化等來參與腎細胞的癌變過程。PM暴露會導(dǎo)致肺細胞內(nèi)cmyc的過度表達，并且可能導(dǎo)致G2/M停滯且加重BEAS-2B中的DNA損傷和細胞凋亡。本研究中得到PM暴露后腎細胞中的c-myc表達水平升高，這與其他學(xué)者的研究結(jié)果相一致。腫瘤抑制基因

p53

對細胞周期、DNA損傷修復(fù)中起著重要的調(diào)控作用。本研究發(fā)現(xiàn)正常細胞在染毒后出現(xiàn)p53表達下降，p53通過調(diào)節(jié)凋亡、細胞周期停滯和自噬等細胞生物學(xué)過程，在急性腎損傷和隨后的腎臟修復(fù)中起關(guān)鍵作用。相對于正常腎細胞，腎癌細胞中的自噬水平較高，通過誘導(dǎo)自噬酶體機制促進p53的降解，表達為p53表達量的下降，同時PM還通過增加DNMT3B蛋白水平來誘導(dǎo)p53啟動子的高度甲基化并抑制其表達。研究表明，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與啟動或增強細胞凋亡機制密切相關(guān)，當(dāng)細胞凋亡發(fā)生紊亂時，往往會導(dǎo)致多種疾病包括癌癥的發(fā)生，所以凋亡往往被看作是一種抗癌過程。Zhu等發(fā)現(xiàn)黃芪甲素可以通過凋亡途徑來抑制A498腎癌細胞的增殖，同時伴有caspase家族蛋白以及Bax蛋白的上調(diào)。Caspase-8是死亡受體通路上關(guān)鍵蛋白酶，它的激活和表達量的增加已被確定為許多惡性腫瘤的重要標(biāo)志物。有研究報道，PM暴露能通過激活凋亡相關(guān)基因

caspase-8

等誘導(dǎo)細胞凋亡。Caspase-9是線粒體通路的關(guān)鍵蛋白酶，它的活化對整個內(nèi)源性凋亡通路的激活尤為重 要。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細胞中的ROS水平升高時會通過各種分子級聯(lián)激活Bcl-2和Bax等凋亡蛋白的表達，最終介導(dǎo)細胞凋亡，

Bcl-2

基因產(chǎn)物可以通過線粒體途徑抑制細胞凋亡，使得腫瘤細胞周期延長，從而抑制腫瘤細胞的快速增殖。本研究結(jié)果表明，PM染毒后

Caspase-8

和

Caspase-9

基因的mRNA和蛋白表達水平升高，Bcl-2 mRNA和蛋白表達水平降低，該結(jié)果提示PM對HK-2腎細胞凋亡基因具有一定的激活作用。由于國內(nèi)外開展PM對腎細胞的毒理學(xué)研究比較少，因此，本文結(jié)果為今后深入探討PM對腎細胞的毒理學(xué)機制提供了一定的科學(xué)依據(jù)，對于PM對多器官多系統(tǒng)的致癌致突變作用研究具有重要意義。