祝斐，應(yīng)博凱，賈超峰，孟乾，高波，孫瑞健，宋雙雙，徐大鳳，盧瑤瑤，張志偉，陳淑吟，張志勇，陳心

（1. 江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇 南通 226000；2. 南通大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南通 226000）

矛尾復(fù)蝦虎魚（Synechogobius hasta） 隸屬于鱸形目（Perciformes）、蝦虎魚科（Gobiidae）、復(fù)蝦虎魚屬（Synechogobius），其具有廣溫廣鹽的特點(diǎn)，在中國、韓國、日本乃至印度尼西亞等沿海地區(qū)的淺海海區(qū)均有分布（陳大剛，1975）。矛尾復(fù)蝦虎魚不僅個(gè)體大（最大可長至500g 以上），且無肌間刺、味道極其鮮美（楊海峰等，2013）。隨著近海開發(fā)和過度捕撈的加劇，矛尾復(fù)蝦虎魚棲息產(chǎn)卵場受到破壞，野生資源量急劇減少。為掌握野生矛尾復(fù)蝦虎魚種質(zhì)資源現(xiàn)狀，亟須開展沿海矛尾復(fù)蝦虎魚群體的遺傳多樣性評(píng)估。

線粒體DNA 因其母系遺傳、進(jìn)化速率快且不易發(fā)生重組的特點(diǎn)，已在水產(chǎn)動(dòng)物種質(zhì)資源評(píng)價(jià)及群體遺傳結(jié)構(gòu)研究中發(fā)揮了重要作用（陳星等，2012）。對(duì)矛尾復(fù)蝦虎魚的研究主要集中在基礎(chǔ)生物學(xué)（張家旭等，2021；孟寬寬等，2017）和苗種繁育（黃金田等，2018；李莉等，2012）等方面，種質(zhì)資源分析及遺傳多樣性評(píng)價(jià)方面的內(nèi)容僅在早些年有過報(bào)道。Song 等（2010）研究表明東營、贛榆等地的核苷酸多樣性較低，無高水平遺傳多樣性，矛尾復(fù)蝦虎魚的資源狀況不容樂觀。宋娜等（2011）對(duì)矛尾復(fù)蝦虎魚群體遺傳多樣性的研究結(jié)果顯示：其各群體相互混雜，丹東與天津群體沒有各自特有的單倍型序列分支；此外，浙江沿海的4個(gè)地區(qū)中只有舟山有少量群體特有的單倍型序列，該6 個(gè)群體單倍型多樣性處于中等水平，無法維持高水平遺傳多樣性。本研究采用線粒體COI 分子標(biāo)記對(duì)長江口、寧波、南通如東、連云港和大連5 個(gè)矛尾復(fù)蝦虎魚群體進(jìn)行遺傳多樣性分析并探討其產(chǎn)生不同地理分布格局的原因，為保證矛尾復(fù)蝦虎魚資源的可持續(xù)利用和開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

矛尾復(fù)蝦虎魚于2019 年11 月分別購自寧波（采樣海區(qū)：121.70毅E，30.06毅N）、長江入?？冢ú蓸雍^(qū)：121.73毅E，31.33毅N）、如東（采樣海區(qū)：121.45毅E，32.54毅N）、連云港（連云港海鮮批發(fā)市場：119.14毅E，34.84毅N） 和大連（大連海鮮市場：121.26毅E，38.81毅N），共5 個(gè)野生群體，每個(gè)群體各30 尾樣品（圖1）。

圖1 矛尾復(fù)蝦虎魚群體的采樣地點(diǎn)

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備 將采集到的樣品剪取適量尾鰭裝入盛有無水乙醇的塑料離心管中并編號(hào)，在-20 益冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 樣品DNA 的提取 使用細(xì)胞/組織基因DNA 提取試劑盒（GK0122 上海捷瑞生物工程有限公司） 提取總gDNA，每個(gè)樣品50 滋L。樣品在1.0%的瓊脂糖凝膠電泳上進(jìn)行檢測，驗(yàn)證高分子量DNA 提取的質(zhì)量。用紫外分光光度計(jì)測定DNA濃度后，于4 益下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR 擴(kuò)增與測序 用Premier 5.0 設(shè)計(jì)一對(duì)引物，上游引物序列ZF1COIF（aat acc aga cgc ccc tat），下游引物序列ZF1/2COIR（gga aga tga acc cca gtg）。PCR 的反應(yīng)體系為25 滋L：2.5 滋L 10 伊PCR buffer，0.5 滋L dNTP Mix，1 滋L Primer ZF2COIF，1 滋L PrimerZF1/2COIR，0.5 滋L Pfu DNA polymerase，2 滋L DNA 模板，用ddH2O 補(bǔ)足至25 滋L（即加入17.5滋LddH2O）。PCR 反應(yīng)程序如下：在95 益下預(yù)變性5 min；在95 益下變性45 s，在50益下退火45 s，在72 益下延伸1 min，共進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)；最后在72 益下延伸5 min，PCR 產(chǎn)物于4 益保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

測序完成后，利用ClustalW 對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行校對(duì)與校正。用DnaSP 5（Librado et al，2009）計(jì)算各群體單倍型數(shù)、單倍型多樣性、核苷酸多樣性、平均核苷酸差異、Tajima憶s D 值和Fu憶s Fs 值。利用Arlequin 3.5 軟件計(jì)算兩兩群體間的遺傳分化指數(shù)（FST） （Excoffier et al，2005），遺傳變異和地理遺傳結(jié)構(gòu)分析采用分子方差分析（Analysis of molecular variance，AMOVA）；利用MEGA 5.1 軟件（Tamura et al，2011）分析序列的堿基組成，計(jì)算群體內(nèi)及群體間的遺傳距離；采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ） （Saitou et al，1987），并基于Kimura 2-parameter model 構(gòu)建矛尾復(fù)蝦虎魚單倍型鄰接關(guān)系進(jìn)化樹（即繪制NJ 鄰接樹），采用Bootstrap（重復(fù)次數(shù)1000）檢驗(yàn)各分支置信度；利用Network 10.2 軟件（Bandelt et al，1999）構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)及進(jìn)化關(guān)系圖。

2 結(jié)果

2.1 序列變異分析

利用NCBI 數(shù)據(jù)庫的Blast 比對(duì)，確定COI 的有效片段為427bp。這5 個(gè)群體的427bp COI 片段，共檢測到15 個(gè)變異位點(diǎn)，占總位點(diǎn)數(shù)的3.51%，其中簡約信息位點(diǎn)11 個(gè)，單獨(dú)位點(diǎn)4 個(gè)，變異均為轉(zhuǎn)換或顛換，轉(zhuǎn)換明顯多于顛換，沒有檢測到插入或缺失現(xiàn)象（表1）。COI 序列中堿基A、T、G、C 的平均含量分別為24.6%、29.6%、20.1%、25.7%，其中T 堿基含量最高，G 堿基含量最低。A+T 的平均含量（54.2%）>C+G 的平均含量（45.8%），表明COI 序列具有AT 偏好性。

表1 矛尾復(fù)蝦虎魚線粒體COI 基因序列變異位點(diǎn)

2.2 單倍型在群體中的分布及遺傳關(guān)系

在150 尾矛尾復(fù)蝦虎魚中共檢測出17 個(gè)單倍型，其中5 個(gè)為共享單倍型，其余12 個(gè)為獨(dú)有單倍型。單倍型Hap2 為5 個(gè)群體的共享單倍型，出現(xiàn)頻次最高，分布于86 個(gè)樣本中，占總樣本數(shù)的57.33%，這可能是矛尾復(fù)蝦虎魚的原始單倍型。5 個(gè)群體的單倍型數(shù)量：連云港群體有8 個(gè)（Hap2、 Hap7、 Hap8、 Hap9、 Hap10、 Hap11、Hap12、Hap13），數(shù)量最多，大連群體有6 個(gè)（Hap1、Hap2、Hap3、Hap4、Hap5、Hap6），長江口 群 體 有6 個(gè)（Hap2、Hap7、Hap8、Hap9、Hap11、Hap14），寧波群體有5 個(gè)（Hap2、Hap8、Hap15、Hap16、Hap17），南通如東群體有3 個(gè)（Hap2、Hap7、Hap8），相對(duì)最少。利用Kimura 2-parameter model 構(gòu)建17 個(gè)單倍型的NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），發(fā)現(xiàn)有一明顯分支（由Hap1、Hap15 構(gòu)成）且節(jié)點(diǎn)支持率不低。利用Network 10.2 軟件分析單倍型之間的進(jìn)化關(guān)系：5 個(gè)群體的單倍型網(wǎng)絡(luò)分布圖呈現(xiàn)一種以5 個(gè)群體的共享單倍型（Hap2）為中心的放射狀結(jié)構(gòu)；5 個(gè)群體中寧波部分群體單倍型和其他四個(gè)群體的單倍型基本處于分割狀態(tài)，表明寧波的部分群體與其他群體存在較大的遺傳距離，這與NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果相一致（圖3）。

圖2 矛尾復(fù)蝦虎魚17 種單倍型在5 個(gè)群體中的分布及其分子系統(tǒng)樹

圖3 矛尾復(fù)蝦虎魚單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

2.3 群體多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)

各群體的單倍型多樣性指數(shù)、核苷酸多樣性指數(shù)等遺傳參數(shù)指標(biāo)如表2 所示。由表可知，各群體的單倍型多樣性為0.343～0.761，各群體核苷酸多樣性為0.000 83～0.003 48，連云港和寧波群體的單倍型多樣性較高（0.761 和0.630），長江和大連群體其次（0.586 和0.579），如東群體的單倍型多樣性較低（0.343）；寧波群體的核苷酸多樣性指數(shù)較高，連云港、大連和長江群體其次，如東群體的核苷酸多樣性指數(shù)較低。以上結(jié)果表明：連云港和寧波群體具有較高的遺傳多樣性，其次是大連和長江群體，如東群體的遺傳多樣性較低。

表2 各群體的單倍型多樣性、核苷酸多樣性和平均核苷酸差異

群體間FST 分析結(jié)果顯示，兩兩群體間的FST值為0.015 57～0.355 66（表3），寧波群體與其他群體間的遺傳分化系數(shù)FST 相對(duì)較大，為0.278 58～0.355 66，且存在顯著差異（P<0.05）。5 個(gè)群體的遺傳距離分析顯示：群體內(nèi)遺傳距離為0.000 83～0.003 50，群體內(nèi)遺傳距離最大的為寧波群體（0.003 50），遺傳距離最小的為如東群體（0.000 83）；兩兩群體間的遺傳距離為0.001 27～0.004 17，寧波群體與其他群體間遺傳距離均相對(duì)較遠(yuǎn)（0.003 36～0.004 17），這與FST 分析結(jié)果相一致。AMOVA 分析結(jié)果表明來自群體內(nèi)的遺傳變異顯著高于來自群體間的遺傳變異百分比（表4）。

表3 矛尾復(fù)蝦虎魚群體內(nèi)遺傳距離及兩兩群體間遺傳距離和遺傳分化系數(shù)（FST）

表4 矛尾復(fù)蝦虎魚群體遺傳差異的AMOVA 分析

2.4 群體歷史動(dòng)態(tài)分析

表2 的中性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，除寧波群體，其他群體的D 值和Fs 值均為負(fù)，表明檢驗(yàn)的結(jié)果偏離了中性模式但不顯著（P>0.1）?？傮w上說，矛尾復(fù)蝦虎魚群體歷史上比較穩(wěn)定，結(jié)合核苷酸不配對(duì)分析結(jié)果與中性檢驗(yàn)結(jié)果大致吻合，即除了長江和連云港群體可能有過較小的群體擴(kuò)張，其他群體均比較穩(wěn)定。

圖5 蝦虎魚核苷酸不配對(duì)分布

3 討論

3.1 群體遺傳多樣性分析

單倍型多樣性和核苷酸多樣性作為線粒體標(biāo)記，是用以衡量遺傳多樣性的重要指標(biāo)，單倍型多樣性和核苷酸多樣性數(shù)值與物種的遺傳多樣性正相關(guān)（Jean-Pierre，2002）。Grant 等（1998）認(rèn)為單倍型多樣性數(shù)值高于0.5、核苷酸多樣性大于0.005則表明物種的多樣性越高，反之越低。本研究中，5 個(gè)矛尾復(fù)蝦虎魚群體單倍型多樣性為0.343～0.761，各群體核苷酸多樣性為0.000 83～0.003 48，將矛尾復(fù)蝦虎魚5 個(gè)群體作為整體，分析結(jié)果顯示，5 個(gè)群體的矛尾復(fù)蝦虎魚單倍型多樣性平均為0.652，核苷酸多樣性平均為0.002 55，表明這5 個(gè)群體的遺傳多樣性處于中等水平，其中寧波群體的遺傳多樣性略高于其他4 個(gè)群體。寧波沿海屬于東海海區(qū)，大連海域?qū)儆诓澈：^(qū)，連云港、長江口和如東海域?qū)儆邳S海海區(qū)，Song 等（2010）認(rèn)為東海矛尾復(fù)蝦虎魚遺傳多樣性和遺傳分化指數(shù)要高于渤海和黃海樣本，本研究支持該觀點(diǎn)。5 個(gè)群體中除了如東群體為低單倍型多樣性和低核苷酸多樣性類型，其他群體都是高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性類型，核苷酸多樣性由于累積時(shí)間遠(yuǎn)大于單倍型多樣性，更能反映群體的遺傳多樣性（Lan et al，1993）。這5 個(gè)群體均呈現(xiàn)出核苷酸多樣性偏低的情況，其主要原因可能是人類活動(dòng)使群體擴(kuò)散以及群體間基因交流受阻導(dǎo)致。如東群體核苷酸多樣性結(jié)果顯示：如東群體近期經(jīng)歷了瓶頸效應(yīng)，而其他群體的低核苷酸多樣性則可能是瓶頸效應(yīng)后群體迅速擴(kuò)張的結(jié)果。矛尾復(fù)蝦虎魚群體這種高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性的現(xiàn)象，在東營、煙臺(tái)（孫志成 等，2020） 和浙江沿海地區(qū)（顧翠平，2014）等地蝦虎魚研究中也出現(xiàn)過，且在其他魚類中也有發(fā)現(xiàn)（李大命等，2020；程清清等，2017；曹洋銘等，2020）。研究者們一致認(rèn)為群體近期可能經(jīng)歷了瓶頸效應(yīng)，又經(jīng)歷了一個(gè)由較小的有效群體快速增長為大群體的過程，也表明了國家對(duì)漁業(yè)資源的保護(hù)政策初見成效。

3.2 蝦虎魚群體遺傳分化分析

矛尾復(fù)蝦虎魚5 個(gè)群體中，寧波群體和其他4 個(gè)群體的遺傳距離相對(duì)較大，但均小于0.01。根據(jù)Shaklee 等（1982）提出的魚類在屬、種和群體三級(jí)水平上遺傳距離分別是0.9、0.30 和0.05 的分類依據(jù)，蝦虎魚的所有群體均未達(dá)到群體的分化標(biāo)準(zhǔn)。寧波群體和其他群體的遺傳距離可能和海水中的環(huán)境屏障有關(guān)。隨著魚類分子系統(tǒng)地理學(xué)研究的深入，發(fā)現(xiàn)除了海洋中的物理障礙可以阻止魚類交流，溫度、海溝等環(huán)境屏障也有同樣作用（Liu et al，2010；Han et al，2010）。宋娜等（2011）對(duì)丹東群體和天津群體之間的斑尾復(fù)蝦虎魚研究也得出了類似結(jié)果，即某種屏障阻礙了群體間的基因交流，可以導(dǎo)致群體遺傳距離的差異。

遺傳分化系數(shù)FST 是反映群體間遺傳分化程度的重要指標(biāo)（Allendorf，1983），F(xiàn)ST 值越高，遺傳分化程度越高。當(dāng)FST 為0～0.05 時(shí)為無分化，0.05～0.15 為中度分化，0.15～0.25 為高度分化，超過0.25 時(shí)則表明存在極大的遺傳分化。由表3 可知寧波群體與其他4 個(gè)群體之間的FST 均超過0.25，且P<0.05，為顯著差異，說明寧波群體與其他4 個(gè)群體間有明顯的遺傳分化；其他群體間多為無分化或中度分化且P>0.05，差異不顯著，這種現(xiàn)象主要原因與遺傳距離差異類似。因?qū)幉ㄅc其以北的長江口之間存在某種環(huán)境屏障，而長江口及其以北地區(qū)間不存在這種屏障且有洋流的輸送作用，導(dǎo)致長江口群體和寧波群體距離上很近但遺傳分化系數(shù)偏大、除寧波外的群體距離上不近但遺傳分化系數(shù)偏小。除如東群體，其余4 個(gè)群體均存在特有的單倍型，這表明群體間存在一定的遺傳分化，但總體而言矛尾復(fù)蝦虎魚群體間分化程度較低。根據(jù)丹東和天津斑尾刺虎魚遺傳多樣性研究，結(jié)果顯示丹東與天津群體相互混雜，沒有群體特有的單倍型序列分支，群體分化程度也較低，與本研究結(jié)果相符（宋娜等，2011）。

3.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析

在單倍型的NJ 進(jìn)化樹中，17 個(gè)單倍型被分為2 個(gè)大分支，寧波的部分群體構(gòu)成的Hap15 與只有單個(gè)個(gè)體的大連的Hap1 構(gòu)成一個(gè)大分支，另一個(gè)大分支由5 個(gè)群體構(gòu)成。根據(jù)遺傳分化系數(shù)FST，寧波群體與其他群體間的遺傳結(jié)構(gòu)存在高度分化；寧波群體與其他4 個(gè)群體的遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)，群體遺傳高度分化且主要的遺傳變異來源于群體內(nèi)，具有一定的地理差異。

4 結(jié)論

本研究通過對(duì)矛尾復(fù)蝦虎魚的5 個(gè)群體進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)只有寧波群體的遺傳多樣性相對(duì)較高，大連、長江口、連云港這3 個(gè)群體的遺傳多樣性較低，如東群體的遺傳多樣性最低，矛尾復(fù)蝦虎魚的群體資源現(xiàn)狀并不樂觀，過度捕撈可能是其遺傳多樣性偏低的主要原因。整體而言，我國矛尾復(fù)蝦虎魚野生種質(zhì)資源現(xiàn)狀堪憂，亟須開展相關(guān)的保護(hù)管理，鑒于長江口以北沿岸地區(qū)的群體未有顯著遺傳分化，可在江蘇、山東等地開展人工育苗和增殖放流增加蝦虎魚資源量，修復(fù)和改善矛尾復(fù)蝦虎魚的棲息環(huán)境、嚴(yán)格控制捕撈強(qiáng)度，從而在不會(huì)產(chǎn)生負(fù)面遺傳效應(yīng)的前提下提高矛尾復(fù)蝦虎魚群體的遺傳多樣性。