劉運(yùn)超，楊蘇珍，陳玉梅，王聚財(cái)，尚延麗，魏 薔，陳維聰，馮 華，張改平

（1. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；2. 鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450001）

豬細(xì)小病毒（Porcine parvovirus，PPV）于1965年首次在德國發(fā)現(xiàn)，是導(dǎo)致豬繁殖失敗的主要病原體之一，臨床上以懷孕母豬發(fā)生死胎、木乃伊化和發(fā)情延遲為主要特征[1-2]，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[3]。我國豬場PPV 檢出率高，常與其他繁殖障礙性疾病病原如豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine productive and respiratory syndrome virus，PRRSV）等混合感染，加重了疾病防控難度[4]。

PPV 屬于細(xì)小病毒科、細(xì)小病毒屬，是一種單鏈、無囊膜的DNA 病毒，病毒粒子直徑為18～26 nm，呈T=1的二十面體結(jié)構(gòu)[5-6]。PPV 基因組全長約5 000 bp，主要包含2 個(gè)開放閱讀框（Open reading frame，ORF），其中ORF1 編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2 和NS3，主要參與病毒DNA 復(fù)制和基因表達(dá)調(diào)控[7-8]；ORF2 編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2 和VP3，主要參與病毒的組裝和感染過程，與病毒的附著、進(jìn)入、定位和病毒粒子組裝密切相關(guān)[9-10]。PPV 的衣殼結(jié)構(gòu)主要由VP1 和VP2 蛋白組成，比例約為1∶20[11]。VP2 蛋白由VP1 蛋白經(jīng)剪切去除VP1 蛋白N端的150 個(gè)氨基酸形成[12]，而VP3 蛋白由VP2 蛋白經(jīng)剪切水解形成[13]。VP2蛋白是PPV 的主要衣殼蛋白，包含PPV 的血凝（Hemagglutination，HA）活性位點(diǎn)和多個(gè)中和性抗原表位，可在體外自組裝成病毒樣顆粒（Viral-like particles，VLP）結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)中和性抗體產(chǎn)生[14-16]。

中和性單克隆抗體具有特異性強(qiáng)、敏感性高，能夠阻斷病毒感染等特點(diǎn)，被廣泛用于病毒的免疫學(xué)檢測、免疫保護(hù)評價(jià)和病毒感染機(jī)制研究等領(lǐng)域[17-20]。孫建慧等[21]利用桿狀病毒表達(dá)的重組PPV VP2蛋白免疫BALB/c小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合后采用免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)（Immunoperoxidase monolayer assay，IPMA）篩選，共獲得8 株抗PPV 的單克隆抗體，這些單克隆抗體均與PPV 感染的豬睪丸細(xì)胞反應(yīng)。劉秀芬等[22]利用干酪乳桿菌表達(dá)的重組PPV VP2 蛋白免疫BALB/c 小鼠，共獲得5 株抗PPV 單克隆抗體。但抗PPV 中和性單克隆抗體的研究鮮有報(bào)道。為此，以重組PPV VP2 蛋白組裝的VLP抗原免疫BALB/c小鼠，通過雜交瘤細(xì)胞融合和IPMA 篩選，制備具有中和PPV 感染活性的單克隆抗體，并對抗體的特異性、敏感性和中和效價(jià)進(jìn)行測定，旨在為PPV 中和性抗原表位研究和免疫檢測試劑開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和病毒 細(xì)胞株SP2/0、PK15、Mac145和病毒株P(guān)PV、豬圓環(huán)病毒2 型（Porcine circovirus 2，PCV2）、PRRSV、豬 瘟 病 毒（Classical swine fever virus，CSFV）均由本實(shí)驗(yàn)室保存。其中，SP2/0細(xì)胞用于與BALB/c 小鼠脾細(xì)胞融合；PK15細(xì)胞用于PPV、CSFV、PCV2 的增殖；Mac145 細(xì)胞用于PRRSV的增殖。

1.1.2 供試動(dòng)物 6～8 周齡雌性BALB/c 小鼠及經(jīng)產(chǎn)母鼠均購自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；6～8周齡雌性BALB/c 小鼠用于單克隆抗體制備，經(jīng)產(chǎn)母鼠用于單克隆抗體腹水的制備。

1.1.3 主要試劑 抗PCV2 單克隆抗體培養(yǎng)上清、PPV 陽性豬血清，均由本實(shí)驗(yàn)室保存；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗His 標(biāo)簽單克隆抗體購自Proteintech 公司；HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG、HRP 標(biāo)記的羊抗豬IgG 購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；RPMI 1640、DMEM 培養(yǎng)基、FBS胎牛血清購自Gibco公司；HT、HAT 培養(yǎng)基、PEG1500、弗氏佐劑購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 重組PPV VP2 蛋白的鑒定 純化的重組PPV VP2 蛋白由本實(shí)驗(yàn)室制備[23]。采用SDS-PAGE和HA 鑒定重組PPV VP2 蛋白的純度和血凝活性。稀釋重組PPV VP2 蛋白至抗原HA 效價(jià)為1∶215，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 動(dòng)物免疫 將5 只BALB/c 小鼠隨機(jī)分為2組，免疫PPV 組3 只小鼠，免疫原為重組PPV VP2抗原，將HA 效價(jià)為1∶215的PPV VP2 蛋白與等體積弗氏佐劑混合乳化后免疫小鼠。對照組2 只小鼠，接種PBS 緩沖液。采用皮下多點(diǎn)注射免疫，共免疫3 次，每次100 μL，免疫間隔14 d。初次免疫使用弗氏完全佐劑，其余采用弗氏不完全佐劑。第3 次免疫后14 d，小鼠斷尾采血，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和血凝抑制試驗(yàn)（Hemagglutination inhibition，HI）檢測小鼠血清中抗PPV 特異性抗體效價(jià)，選定效價(jià)最高小鼠腹腔注射25 μg（體積50 μL）重組PPV VP2 蛋白，進(jìn)行加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫后3 d進(jìn)行細(xì)胞融合。

1.2.3 細(xì)胞融合與陽性雜交瘤細(xì)胞株的篩選 取加強(qiáng)免疫后3 d 的BALB/c 小鼠，脫頸處死，無菌取出小鼠脾臟，制備脾細(xì)胞懸液，與SP2/0 細(xì)胞按照5∶1的比例混合，逐滴加入PEG1500進(jìn)行細(xì)胞融合。以HAT 選擇培養(yǎng)基稀釋融合后細(xì)胞，將懸浮細(xì)胞均勻鋪至20 塊96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔300 μL，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d。以IPMA 進(jìn)行陽性克隆篩選，以有限稀釋法對陽性細(xì)胞孔連續(xù)進(jìn)行亞克隆，獲得能穩(wěn)定分泌抗PPV 的陽性單克隆雜交瘤細(xì)胞株。

1.2.4 IPMA 試驗(yàn) 按每孔6×105個(gè)細(xì)胞將PK15 細(xì)胞鋪至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿孔底80%，每孔接種200 TCID50PPV，37 ℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)72 h。以含4% H2O2的甲醇溶液固定96 孔板中細(xì)胞15 min，棄固定液，加入含5%脫脂牛奶粉的PBST 緩沖液，4 ℃封閉過夜。棄封閉液，按照每孔50 μL的量向細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入按比例倍比稀釋的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液上清或單克隆抗體腹水，37 ℃孵育20 min 后，以PBST 洗滌6 次，按照每孔50 μL 加入1∶1 000 稀釋的HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37 ℃孵育30 min，棄去培養(yǎng)板中溶液，以PBST 洗滌6 次，雙蒸水洗1 次，每孔加入100 μL AEC 顯色液，室溫顯色10 min，倒置顯微鏡下觀察。

1.2.5 病毒中和試驗(yàn) 按照參考文獻(xiàn)[24]所述，采用病毒中和試驗(yàn)篩選中和性單克隆抗體，設(shè)抗PCV2 單克隆抗體培養(yǎng)上清為陰性對照（Negative control，NC）。將PPV 用無血清培養(yǎng)基稀釋至200 TCID50，與雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清1∶1（V/V）混合，37 ℃孵育1 h。向96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)的PK15 細(xì)胞加入上述混合物，100 μL/孔，37 ℃、5% CO2孵育2 h。棄去細(xì)胞板中液體，加入含2% FBS 的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)20 h。棄去培養(yǎng)上清，加入含有4% H2O2的甲醇固定液，室溫孵育15 min。以1∶500稀釋的PPV 陽性豬血清為一抗，1∶1 000稀釋的HRP 標(biāo)記的羊抗豬IgG 為二抗，參照IPMA 方法檢測培養(yǎng)孔中PPV 增殖情況，篩選具有中和PPV感染活性的雜交瘤細(xì)胞株，將陽性細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，液氮保存。

1.2.6 單克隆抗體腹水的制備及效價(jià)測定 將陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，收集備用。取經(jīng)產(chǎn)BALB/c 母鼠，腹腔注射液體石蠟（0.5 mL/只），10 d后腹腔注射2.5×106個(gè)雜交瘤細(xì)胞（0.5 mL/只）。8～12 d 后，待小鼠腹部明顯膨大，抽取腹水。10 000 r/min 離心10 min，收集上清，-70 ℃以下凍存?zhèn)溆谩７謩e用純化的重組PPV VP2 蛋白和PPV 病毒粒子作為包被原，將10 倍稀釋的單克隆抗體腹水2 倍倍比稀釋后作為一抗，HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 作為二抗，建立ELSIA 方法測定單克隆抗體腹水效價(jià)，每個(gè)樣品重復(fù)3 次，以陰性孔OD450值2.1 倍為閾值，判定為陽性。

1.2.7 單克隆抗體的特異性鑒定 采用IPMA 法鑒定單克隆抗體的特異性。分別取PPV、PRRSV、CSFV、PCV2 感染的細(xì)胞，以1∶5 000 稀釋的抗PPV單克隆抗體腹水為一抗、HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 抗體為二抗，參照上述IPMA 方法，鑒定單克隆抗體的特異性。

1.2.8 單克隆抗體的Western blot 鑒定 將純化的重組PPV VP2 蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，隨后轉(zhuǎn)印硝酸纖維素膜，以1∶5 000 稀釋的抗PPV 單克隆抗體腹水為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，進(jìn)行Western blot 檢測，設(shè)置抗His 標(biāo)簽單克隆抗體為一抗作為陽性對照。

1.2.9 單克隆抗體病毒中和效價(jià)檢測 將純化的單克隆抗體腹水系列稀釋后與200 TCID50的PPV 混合，然后將混合物加入到長滿PK15 細(xì)胞的96 孔培養(yǎng)板。參照1.2.5中的方法，以PPV陽性豬血清為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG抗體為二抗，以腹水完全抑制PPV 病毒增殖的最高稀釋倍數(shù)作為最終的抗體中和效價(jià)。

1.2.10 單克隆抗體亞型鑒定 按照Proteintech 公司小鼠單克隆抗體亞型鑒定用ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 PPV VP2蛋白純化結(jié)果

SDS-PAGE 結(jié)果表明，大腸桿菌表達(dá)的重組PPV VP2蛋白分子質(zhì)量約為64 ku，蛋白質(zhì)純度可達(dá)80%以上（圖1A），純化的VP2 蛋白具有類似天然PPV 病毒粒子的凝集小鼠紅細(xì)胞的HA 活性，HA 效價(jià)為1∶214（圖1B）。

2.2 BALB/c小鼠血清效價(jià)

為了檢測小鼠的血清效價(jià)，在第3 次免疫后第14天，采用間接ELISA和HI方法檢測小鼠血清中的抗體水平。結(jié)果顯示，免疫PPV VP2 蛋白組小鼠產(chǎn)生了抗PPV VP2 蛋白的特異性抗體，其ELISA 效價(jià)在1∶214～1∶216，HI 效價(jià)可達(dá)1∶216，免疫PBS 對照組BALB/c小鼠未檢測到抗PPV VP2抗體（表1）。

表1 免疫BALB/c小鼠血清效價(jià)Tab.1 Serum titer of immunized BALB/c mice

2.3 抗PPV中和性單克隆抗體的篩選

通過經(jīng)典的雜交瘤融合技術(shù)制備雜交瘤細(xì)胞株，經(jīng)有限稀釋法對雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行亞克隆，以IPMA 方法篩選特異性識(shí)別PPV 的單克隆抗體，并采用1.2.5 所述病毒中和試驗(yàn)方法從抗PPV 特異性抗體中篩選具有中和PPV 感染活性的雜交瘤細(xì)胞株，共篩選到2 株中和性單克隆抗體5F7 和11B3。IPMA 結(jié)果顯示，單克隆抗體5F7 和11B3 均能與PPV 發(fā)生特異性反應(yīng)（圖2）。將200 TCID50PPV 分別與梯度稀釋的單克隆抗體混合，進(jìn)行病毒中和試驗(yàn)，結(jié)果顯示，5F7 和11B3 的中和效價(jià)分別為1∶211和1∶210。

2.4 抗PPV中和性單克隆抗體的鑒定

2.4.1 ELISA 檢測結(jié)果 用間接ELISA 方法，以單克隆抗體5F7 和11B3 腹水和雜交瘤培養(yǎng)上清為一抗，檢測PPV 與重組VP2 蛋白的反應(yīng)性。結(jié)果顯示，5F7 和11B3 兩株單克隆抗體均與PPV 和重組VP2 蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，其中單克隆抗體5F7 和11B3 雜交瘤細(xì)胞株培養(yǎng)上清對重組VP2 蛋白的效價(jià)分別為1∶6 400 和1∶12 800（圖3A）；5F7 和11B3腹水對重組VP2 蛋白的效價(jià)均為1∶4 096 000，與PPV的結(jié)合效價(jià)可達(dá)1∶10 240和1∶20 480（圖3B）。

2.4.2 Western blot 分析 將純化的重組PPV VP2蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)印硝酸纖維素膜，分別以5F7 和11B3 腹水為一抗進(jìn)行Western blot 檢測，結(jié)果如圖4所示。2株單克隆抗體5F7（圖4A）和11B3（圖4B）不能與變性的VP2 蛋白結(jié)合，而抗His標(biāo)簽單克隆抗體可以與變性的重組VP2 蛋白結(jié)合（圖4C），說明5F7 和11B3 識(shí)別的抗原表位為構(gòu)象表位。

2.4.3 單克隆抗體特異性分析 2 株中和性單克隆抗體的腹水1∶5 000 稀釋后，與不同病毒進(jìn)行IPMA檢測，結(jié)果如圖5 所示。2 株中和性單克隆抗體5F7、11B3只與PPV反應(yīng)，與PCV2、PRRSV、CSFV 等病毒均不反應(yīng)，表明本研究篩選的中和性單細(xì)胞株 具有良好的特異性。

2.4.4 單克隆抗體亞型鑒定 單克隆抗體5F7 和11B3 分屬于2 種不同的抗體亞型，其重鏈分別為IgG2a和IgG2b，輕鏈均為Kappa（圖6）。

3 結(jié)論與討論

PPV 是一種引起豬繁殖障礙性疾病的病毒，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失，威脅生豬種質(zhì)資源安全。VP2 蛋白是PPV 的主要結(jié)構(gòu)蛋白，含有重要的抗原表位，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的中和抗體，是制備PPV 單克隆抗體的理想抗原[25]。PPV VP2蛋白已在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)和大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)[26]。筆者所在課題組前期制備了大腸桿菌表達(dá)的重組PPV VP2 蛋白，并在體外自組裝形成VLP結(jié)構(gòu)，該VLP 具有血凝活性，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高滴度的中和性抗體[27]。在此基礎(chǔ)上，本研究以重組PPV VP2 蛋白為抗原與佐劑混合乳化后免疫BALB/c 小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合和IPMA 篩選，獲得2 株具有中和PPV感染活性的單克隆抗體5F7和11B3。

本研究以重組VP2 蛋白血凝效價(jià)為免疫單位，而不僅僅以VP2 蛋白的含量為依據(jù)進(jìn)行免疫，有效誘導(dǎo)小鼠中和抗體的產(chǎn)生，提升了中和性單克隆抗體的篩選效率。經(jīng)該方法制備的單克隆抗體5F7和11B3 均與重組PPV VP2 蛋白和PPV 病毒粒子發(fā)生特異性反應(yīng)，提示2 株單克隆抗體能夠識(shí)別重組PPV VP2蛋白和PPV病毒粒子表面B細(xì)胞表位。同時(shí)，Western blot檢測結(jié)果顯示，2株單克隆抗體與變性的重組PPV VP2 蛋白均不反應(yīng)，表明在變性條件下被單克隆抗體識(shí)別的抗原表位發(fā)生變化，提示這2 株中和性單克隆抗體僅識(shí)別重組VP2 蛋白的構(gòu)象型表位。病毒中和試驗(yàn)結(jié)果顯示，單克隆抗體5F7中和PPV 感染效價(jià)可達(dá)1∶211，單克隆抗體11B3 的中和效價(jià)1∶210，均具有較高的中和病毒感染活性。經(jīng)鑒定，2 株單克隆抗體的輕鏈均為Kappa 型，5F7的重鏈為IgG2a 亞型，11B3 的重鏈為IgG2b 亞型，2株單克隆抗體均具有良好的特異性，不與PCV2、PRRSV 和CSFV發(fā)生交叉反應(yīng)。中和性單克隆抗體特異性識(shí)別抗原的中和性表位，利用中和性單克隆抗體進(jìn)行抗原表位的定位，是研究B 細(xì)胞抗原表位的經(jīng)典方法。同時(shí)，中和性單克隆抗體能夠有效阻斷病毒對宿主細(xì)胞的侵染，防止病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞，具有被開發(fā)為治療性藥物的潛力。

本研究成功獲得了2株針對PPV VP2蛋白構(gòu)象表位的特異性中和單克隆抗體，可為進(jìn)一步研制PPV 抗原免疫檢測產(chǎn)品提供技術(shù)支撐，同時(shí)為PPV中和性表位鑒定和病毒吸附、感染機(jī)制等方面的研究奠定基礎(chǔ)。