顏世君，郝麗影，白露露，鄭丁丁，宋歡歡，李勝?gòu)?qiáng)，王同燕，譚菲菲，鄧均華，田克恭，

（1. 國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽(yáng) 471000；2. 普萊柯生物工程股份有限公司，河南 洛陽(yáng) 471000；3. 洛陽(yáng)普泰生物技術(shù)有限公司，河南 洛陽(yáng) 471000）

非洲豬瘟病毒是非洲豬瘟病毒科的唯一成員，具有高度傳染性，感染后可導(dǎo)致家豬高燒、出血性病變、發(fā)紺、厭食，甚至死亡[1-3]。該病毒起源于非洲，隨后從非洲傳到歐洲，后來(lái)又傳到南美洲和加勒比地區(qū)[4-5]，2018 年傳至中國(guó)并在中國(guó)快速傳播，對(duì)中國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成嚴(yán)重威脅[6]。

非洲豬瘟病毒是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的有囊膜病毒，呈二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)[7-10]。含有一個(gè)大的雙鏈DNA基因組（170～190 kb），編碼多種蛋白質(zhì)[11-12]，目前僅從其中鑒定出約68 種結(jié)構(gòu)蛋白，包括pp220、pp62、p72、p54、p22、p11.5、p12、p17、p10、p14.5、p150、p37、p34、p14 和CD2v 蛋白等[13-14]。但是，大多數(shù)非洲豬瘟病毒基因的作用仍然未知，不利于疫病控制。

p22 蛋白由KP177L基因編碼，是非洲豬瘟病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白。p22 蛋白為早期蛋白，位于病毒顆粒外部，可被非離子去污劑從病毒顆粒表面上溶解釋放出來(lái)[15]。用桿狀病毒表達(dá)的非洲豬瘟病毒p54 和p30 蛋白免疫豬能誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生，部分豬能抵御強(qiáng)毒株的攻擊[16-17]。但是用桿狀病毒表達(dá)的p30、p54、p72 和p22 蛋白同時(shí)免疫豬，雖然能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生高滴度具有中和活性的抗體，卻不能抵御強(qiáng)毒株的攻擊[18]。p22 蛋白作為非洲豬瘟病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，其具體的生物學(xué)功能尚不清楚。特異性高、敏感性強(qiáng)的單克隆抗體是免疫學(xué)診斷試劑研發(fā)中最關(guān)鍵的生物材料[19-20]。為此，利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)非洲豬瘟病毒p22 蛋白，并制備單克隆抗體，以期為p22 蛋白的結(jié)構(gòu)功能研究、亞單位疫苗及診斷試劑開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 感受態(tài)細(xì)胞和表達(dá)載體 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技有限公司；DH10Bac 感受態(tài)、pFastBac Ⅰ表達(dá)載體等均由本研究中心保存。

1.1.2 細(xì)胞及試驗(yàn)動(dòng)物 sf9 昆蟲細(xì)胞及SP2/0 骨髓瘤細(xì)胞由本研究中心保存；BALB/c試驗(yàn)小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.1.3 試驗(yàn)試劑BamHⅠ和HindⅢ購(gòu)自NEB 公司；T4 DNA 連接酶購(gòu)自Thermo Fisher Scientific 公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HAT 混合鹽、HT混合鹽、50%的PEG 1500、HRP標(biāo)記二抗及FITC標(biāo)記二抗均購(gòu)自Sigma 公司；baculoFECTIN Ⅱ昆蟲細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自O(shè)ET 公司；IB905 無(wú)血清培養(yǎng)基購(gòu)自壹生科（深圳）有限公司；高保真DNA 聚合酶、dNTP、DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)均購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司公司；質(zhì)粒提取試劑盒及膠回收試劑盒均購(gòu)自ENZA 公司；小鼠單克隆抗體分型ELISA 試劑盒購(gòu)自洛陽(yáng)佰奧通實(shí)驗(yàn)材料中心；預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自麥約爾生物技術(shù)有限公司；非洲豬瘟陽(yáng)性血清、非洲豬瘟96 孔抗原板購(gòu)于歐盟參考實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 重組p22蛋白的表達(dá)及鑒定

1.2.1.1 基因合成 根據(jù)GenBank 中登錄號(hào)為KJ380912.1 的p22基因序列，委托金維智生物科技有限公司合成密碼子優(yōu)化后的p22基因。

1.2.1.2 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)優(yōu)化后的p22基因序 列，設(shè) 計(jì) 正 向 引 物（p22-F）序 列：5′-CGCGGATCCATGACTACCCACATCTTCCACGCTG-3′（包含BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)），反向引物（p22-R）序列：5′-CCCAAGCTTTTAGTGGTGATGGTGGTGGTGAGCGATAGCGATTTGG-3′（包 含Hind Ⅲ酶 切 位點(diǎn)）。同時(shí)按照Bac-to-Bac 操作說(shuō)明書所述方法，合成1 對(duì)引物Bac13F/Bac13R，用于重組桿狀病毒質(zhì)粒（Bacmid）的PCR 鑒定。引物由金斯瑞生物科技生物科技有限公司合成。

1.2.1.3 pFastBac-p22供體質(zhì)粒的構(gòu)建 分別將pFastBac Ⅰ和p22基因片段用BamHⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，1%凝膠電泳后，回收p22基因和pFastBac Ⅰ載體片段，連接后轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，涂布含100 μg/mL 氨芐青霉素抗性的LB固體平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，挑取單菌落，37 ℃、200 r/min 過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定后送測(cè)序，鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pFastBac-p22。

1.2.1.4 重組Bacmid 的構(gòu)建 取1 ng pFastBacp22，加至100 μL DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴熱擊后接入LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min 條件下培養(yǎng)4 h。涂布含有卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素的藍(lán)白斑篩選平板上。37 ℃培養(yǎng)48 h，挑取白色菌落，37 ℃、220 r/min 搖床培養(yǎng)過(guò)夜，用堿裂解與乙醇沉淀結(jié)合的方法提取重組Bacmid，并用引物Bac13F/Bac13R 進(jìn)行PCR 鑒定，將鑒定正確的重組Bacmid命名為rBacmid-p22。

1.2.1.5重組桿狀病毒的拯救 按照baculoFECTIN Ⅱ轉(zhuǎn)染試劑操作說(shuō)明，將rBacmidp22轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞置于27 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)大約96 h，當(dāng)80%細(xì)胞出現(xiàn)病變后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，獲得重組桿狀病毒。

1.2.1.6 重組蛋白的表達(dá)及鑒定 分別將拯救獲得的重組桿狀病毒及野毒感染sf9 細(xì)胞，待80%以上的細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，離心收集細(xì)胞，超聲破碎后離心取上清制備樣品，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，半干法轉(zhuǎn)至NC 膜上，封閉后，分別以1∶200 稀釋的非洲豬瘟標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清作為一抗，1∶2 000 稀釋的HRP 標(biāo)記的羊抗豬IgG作為二抗進(jìn)行Western blot鑒定。

1.2.1.7 重組非洲豬瘟病毒p22 蛋白的表達(dá)和純化 于搖瓶中將重組桿狀病毒接種sf9 細(xì)胞，27 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)，當(dāng)病變大于80%時(shí)，離心收集細(xì)胞，用pH 值8.3、25 mol/L NaHCO3裂解收集細(xì)胞，4 ℃條件下11 000×g離心30 min，將上清用Ni 柱進(jìn)行親和層析純化，獲得粗純的蛋白質(zhì)，進(jìn)一步用分子篩純化，對(duì)獲得的目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。

1.2.2 抗非洲豬瘟病毒p22蛋白的單克隆抗體制備及鑒定

1.2.2.1 雜交瘤細(xì)胞株的篩選 將純化的p22 蛋白與弗氏完全佐劑等體積混合乳化后作為抗原進(jìn)行首免，背部皮下途徑免疫4 至6 周齡的BALB/c 小鼠，100 μg/只。每間隔14 d，用弗氏不完全佐劑乳化的p22 抗原進(jìn)行二免和三免。使用純化的p22 蛋白作為抗原包被酶標(biāo)板，通過(guò)間接ELISA 評(píng)估免疫BALB/c小鼠血清的抗體滴度，選擇抗體效價(jià)最高的小鼠，于細(xì)胞融合前3 d，用純化的p22 蛋白進(jìn)行最終免疫。從最終免疫的小鼠脾臟中分離脾細(xì)胞，與處在對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的SP2/0骨髓瘤經(jīng)PEG 1500處理進(jìn)行細(xì)胞融合。于融合后9～11 d 進(jìn)行陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的篩選，對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋亞克隆，直至所有的克隆孔間接ELISA 方法檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，完成篩選，對(duì)獲得的雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行凍存。

1.2.2.2 腹水制備及效價(jià)測(cè)定 取經(jīng)產(chǎn)雌性BALB/c 小鼠，腹腔注射1 mL 液體石蠟。7 d 后，相同途徑注射篩選獲得的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株。接種后7～11 d，小鼠腹部膨脹明顯，采集腹水，離心取上清，通過(guò)間接ELISA方法測(cè)定腹水中的抗體效價(jià)。

1.2.2.3 單克隆抗體亞類鑒定 按照說(shuō)明書所述方法，采用小鼠單克隆抗體分型ELISA 試劑盒對(duì)篩選獲得的單克隆抗體進(jìn)行亞類鑒定。

1.2.2.4 間接免疫熒光（IFA）鑒定單克隆抗體與非洲豬瘟病毒反應(yīng)性 取接種有非洲豬瘟病毒的96孔抗原板，首先與1∶200 稀釋的待檢測(cè)的單克隆抗體反應(yīng)，同時(shí)以SP2/0 骨髓瘤細(xì)胞接種小鼠后采集的腹水作為陰性對(duì)照，然后與1∶1 000 稀釋的FITC標(biāo)記的兔抗鼠IgG反應(yīng)，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 p22基因的擴(kuò)增及供體質(zhì)粒pFastBac-p22的構(gòu)建

用p22-F/p22-R 引物，以合成的p22基因?yàn)槟０鍞U(kuò)增出目的片段，大小約485 bp（圖1A）。通過(guò)BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)將p22基因插入到pFastBac Ⅰ中，并進(jìn)行酶切鑒定。結(jié)果顯示，出現(xiàn)大小474 bp 和4 671 bp 的條帶（圖1B），與預(yù)期的基因片段及載體片段的大小一致，表明目的基因插入到pFastBac Ⅰ載體中。經(jīng)測(cè)序鑒定分析，p22編碼區(qū)序列正確，表明p22基因克隆成功。

2.2 重組rBacmid-p22的構(gòu)建和鑒定

用Bac13F/R 引物對(duì)rBacmid-p22進(jìn)行PCR 鑒定，擴(kuò)增出約2 800 bp 的目的條帶（圖2）。表明p22基因被成功插入到桿狀病毒載體上。

2.3 重組桿狀病毒AcNPV-p22的拯救

將構(gòu)建的rBacmid-p22轉(zhuǎn)染sf9 昆蟲細(xì)胞，48 h開始出現(xiàn)細(xì)胞病變，表現(xiàn)為細(xì)胞直徑增加、生長(zhǎng)停滯、細(xì)胞內(nèi)部出現(xiàn)顆粒體，96 h 后觀察，細(xì)胞病變大于80%，收獲培養(yǎng)上清，即為含有非洲豬瘟病毒p22基因的重組桿狀病毒AcNPV-p22。

2.4 重組p22蛋白的表達(dá)鑒定

分別取接種野毒及AcNPV-p22病變達(dá)80%以上的sf9細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液裂解后離心，取上清進(jìn)行Western blot鑒定。結(jié)果顯示，在22 ku處出現(xiàn)特異性條帶（圖3）。表明重組蛋白在sf9細(xì)胞內(nèi)以可溶形式表達(dá)。

2.5 重組p22蛋白的純化

通過(guò)親和層析方法用Ni 柱對(duì)收獲的細(xì)胞裂解樣品進(jìn)行粗純，然后通過(guò)分子篩對(duì)粗純后的p22 蛋白進(jìn)一步純化，最終獲得條帶大小約22 ku的p22重組蛋白（圖4）。

2.6 抗p22蛋白單克隆抗體制備

經(jīng)過(guò)篩選，最終獲得2株雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為3D2、4A7。2 株雜交瘤細(xì)胞腹水效價(jià)在1∶128 000～1∶512 000。

2.7 抗p22蛋白單克隆抗體亞類鑒定

2 株抗p22 蛋白單克隆抗體重鏈均為IgG1，輕鏈均為κ。

2.8 抗p22蛋白單克隆抗體與非洲豬瘟病毒反應(yīng)性的鑒定

IFA 結(jié)果表明，單克隆抗體孔中，均能在熒光顯微鏡下觀察到熒光信號(hào)，陰性對(duì)照孔無(wú)熒光信號(hào)（圖5）。表明制備的單克隆抗體均能與非洲豬瘟病毒發(fā)生特異性反應(yīng)。

3 結(jié)論與討論

非洲豬瘟病毒基因組編碼多達(dá)150 種蛋白質(zhì)，其中大部分蛋白質(zhì)功能仍然未知，了解病毒蛋白質(zhì)在病毒吸附、入侵和復(fù)制過(guò)程中的作用對(duì)于開發(fā)新的疫病防控策略至關(guān)重要[21]。p22 蛋白是非洲豬瘟病毒感染后早期轉(zhuǎn)錄的病毒跨膜結(jié)構(gòu)蛋白，位于非洲豬瘟病毒顆粒的內(nèi)膜和感染細(xì)胞的表面。有研究表明，非洲豬瘟病毒p22 蛋白可以與參與不同細(xì)胞通路的幾種宿主蛋白相互作用，這些通路有助于病毒感染過(guò)程的內(nèi)吞作用[22]。這表明p22 蛋白在非洲豬瘟病毒體外和體內(nèi)復(fù)制過(guò)程中發(fā)揮重要作用。但是，缺失p22基因不影響非洲豬瘟病毒的復(fù)制及病毒毒力[22]。同時(shí)有研究表明，p22 蛋白同時(shí)可以誘導(dǎo)豬產(chǎn)生體液免疫及細(xì)胞免疫[23-24]?？梢姡磉_(dá)具有生物學(xué)活性的p22蛋白并制備相應(yīng)的單克隆抗體，對(duì)進(jìn)一步研究p22蛋白功能、開發(fā)非洲豬瘟病毒亞單位疫苗及診斷試劑十分重要。

本研究成功的表達(dá)了可溶形式的重組蛋白p22，且SDS-PAGE 結(jié)果表明，目的蛋白大小約22 ku；Western blot 鑒定表明，重組p22 蛋白與非洲豬瘟病毒陽(yáng)性血清具有良好的反應(yīng)原性。以重組p22 蛋白免疫小鼠制備了2 株抗非洲豬瘟病毒p22蛋白的單克隆抗體，ELISA 效價(jià)不低于1∶128 000。IFA 結(jié)果表明，單克隆抗體能特異性識(shí)別非洲豬瘟病毒。本研究獲得的p22重組蛋白及其單克隆抗體為p22 蛋白的功能研究、非洲豬瘟病毒檢測(cè)及疾病控制提供了有效工具。

綜上，利用桿狀病毒-昆蟲表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了大小約為22 ku的可溶性的重組p22蛋白，用表達(dá)的p22 蛋白免疫BALB/c 小鼠，篩選獲得了2 株能特異性識(shí)別p22 蛋白，且與非洲豬瘟病毒反應(yīng)性良好的單克隆抗體。這為后續(xù)p22蛋白功能的研究及非洲豬瘟病毒診斷試劑的開發(fā)提供了重要的生物材料。