劉曉雪，王春霞，劉利娟，郭金英，鄭素月

（河北工程大學(xué) 園林與生態(tài)工程學(xué)院，河北 邯鄲056038）

平菇（Pleurotus ostreatus）食味鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，具有極高的食藥用價(jià)值，特別是其富含的黃酮類(lèi)、有機(jī)酸、幾丁質(zhì)等多種活性成分可以有效抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，增強(qiáng)人體免疫力[1-2]。近年來(lái)隨著人們對(duì)飲食健康越來(lái)越重視，對(duì)平菇的需求與日劇增。同時(shí)，作為適應(yīng)性較強(qiáng)的側(cè)耳屬木腐真菌[3]，平菇的栽培范圍遍及全球各大洲，我國(guó)是平菇栽培大國(guó)，據(jù)中國(guó)食用菌協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)，2019 年我國(guó)平菇產(chǎn)量686.47萬(wàn)t，為我國(guó)栽培量?jī)H次于香菇和黑木耳的第三大食用菌品種[4]。

目前我國(guó)的食用菌基本實(shí)現(xiàn)人工種植，其栽培技術(shù)已非常成熟，但是在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中經(jīng)常因?yàn)榫杲慌湫蜔o(wú)法準(zhǔn)確鑒定，而導(dǎo)致產(chǎn)生親和率下降、產(chǎn)量不穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)效益下滑等問(wèn)題[5-7]，給食用菌產(chǎn)業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失，因此菌株交配型的鑒定尤為重要[8]。平菇是擔(dān)子菌中標(biāo)準(zhǔn)的四極性異宗結(jié)合菌[9]，其交配型系統(tǒng)研究最早開(kāi)始于20 世紀(jì)20 年代[10]，研究者對(duì)交配型做了大量工作。季哲等[11]以2個(gè)黃傘子實(shí)體為材料，用孢子稀釋法分離孢子，經(jīng)3輪雜交后，鑒定出黃傘為四極性異宗配合的擔(dān)子菌。余梅等[12]采用原生質(zhì)體單核化和單孢分離的方法發(fā)現(xiàn)，真姬菇為四極性異宗結(jié)合擔(dān)子菌。楊軍等[13]通過(guò)核遷移試驗(yàn)鑒定出灰樹(shù)花屬于四極性交配系統(tǒng)。馮偉林等[14]鑒定出杏鮑菇屬于四極性異宗配合系統(tǒng)，并且應(yīng)用ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)獲取的4 種不同交配型的單核體進(jìn)行DNA 指紋分析，認(rèn)為ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)可以作為食用菌單核菌株鑒別及指紋分析的有效工具?？卤箝诺萚15]以赤芝JC 和AL 菌株為試驗(yàn)對(duì)象，在常規(guī)交配型測(cè)定的基礎(chǔ)上，采用OWE-SOJ 技術(shù)對(duì)其單核菌株交配類(lèi)型進(jìn)行測(cè)定，確定了赤芝為四極性異宗結(jié)合菌。程莉等[16]采用標(biāo)準(zhǔn)測(cè)交法鑒定糙皮側(cè)耳的交配型系統(tǒng)為四極性異宗配合真菌。單核菌株作為重要的育種材料[17-18]，對(duì)交配系統(tǒng)的分析至關(guān)重要。交配系統(tǒng)以及交配行為的研究不僅僅是雜交育種工作的基礎(chǔ)，也是從交配型因子的角度理解和評(píng)價(jià)菌株資源遺傳多樣性的基礎(chǔ)。交配型涉及親和雜交、雙核菌絲體構(gòu)建和子實(shí)體發(fā)育等重要生理過(guò)程，是值得深入研究的一個(gè)課題[19]。對(duì)側(cè)耳屬菌株的研究雖然已經(jīng)獲得了部分菌株的基因組序列，但是食用菌交配型位點(diǎn)和基因的研究仍舊存在很多空白，還沒(méi)有從全基因組的水平對(duì)這些物種的交配型位點(diǎn)和交配型基因進(jìn)行深入研究[20]。并且目前關(guān)于野生側(cè)耳屬菌種的鑒定及交配型分析更是鮮見(jiàn)報(bào)道。為此，在ITS鑒定的基礎(chǔ)上，通過(guò)單孢分離法對(duì)1株野生側(cè)耳屬平菇菌株進(jìn)行孢子單核菌株分離，經(jīng)過(guò)3 輪雜交和核遷移試驗(yàn)，對(duì)該平菇菌株的4 種交配型進(jìn)行鑒定，為今后從交配型因子的角度深入研究側(cè)耳屬平菇的遺傳規(guī)律及擴(kuò)充種質(zhì)資源庫(kù)等工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

野生平菇子實(shí)體采集于河北工程大學(xué)原中華南校區(qū)一棵龍爪槐樹(shù)干上，由河北工程大學(xué)食用菌研究室分離、鑒定和保藏，菌株編號(hào)為Po15。

1.2 方法

1.2.1 ITS 鑒定 采用DNA 試劑盒（天根生化科技北京有限公司）提取菌絲體DNA，利用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATTGATATGC-3′）進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行克隆測(cè)序。將得到的菌株ITS 序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST 比對(duì)，利用ClustalX 軟件對(duì)所得序列進(jìn)行校正和比對(duì)分析，采用MEGA 6.0 軟件以Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.2 單孢分離方法 采集平菇子實(shí)體進(jìn)行多孢分離和單孢分離，具體方法參考文獻(xiàn)[21]。

1.2.3 交配型測(cè)定方法 單核菌株交配型常規(guī)測(cè)定參照張樹(shù)庭等[22]方法，測(cè)定程序如表1所示。

表1 四極性交配型測(cè)定程序Tab.1 Procedure for determination of tetrapolar mating type

1.2.4 核遷移試驗(yàn) 參考程莉等[16]、李安政等[23]方法，采用核遷移試驗(yàn)對(duì)該平菇的交配型進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS鑒定和分析

利用ITS1 和ITS4 通用引物對(duì)野生菌株進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序后，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST 比對(duì)，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)序列與登錄號(hào)為L(zhǎng)C149608.1 的平菇菌株同源性達(dá)到99.71%。并通過(guò)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析（圖1），該野生菌種與Pleurotus pulmonarius（肺形側(cè)耳）、Pleurotus floridanus（佛州側(cè)耳）具有一定的遺傳距離，而與Pleurotus ostreatus（MT778826、MT778816、MT778817）3 個(gè)平菇菌種相似性達(dá)到100%。因此，結(jié)合形態(tài)學(xué)可確定分離菌株為糙皮側(cè)耳。

2.2 單核菌株群體的獲得

根據(jù)單孢分離法，挑取了100個(gè)菌株，經(jīng)顯微觀察和生長(zhǎng)速度測(cè)定，剔除有鎖狀聯(lián)合及長(zhǎng)速較差菌株，最終獲得69株可用的孢子單核菌株。對(duì)其生長(zhǎng)速度、菌落形態(tài)等生物學(xué)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，69 株單核菌株的菌落形態(tài)主要分為4 類(lèi)（圖2），與程爽爽等[25]在香菇單核菌絲研究中的結(jié)果一致。4種類(lèi)型包含的菌株見(jiàn)表2。

表2 糙皮側(cè)耳單核菌株的菌落形態(tài)分類(lèi)結(jié)果Tab.2 Classification results of monokaryon strains from Pleurotus ostreatus by colony types

2.3 交配型鑒定結(jié)果

根據(jù)四級(jí)性交配型測(cè)定程序?qū)@取的69 株單核菌株進(jìn)行交配型鑒定。首先將P1 菌株假設(shè)為T(mén)1（AxBx）進(jìn)行68組配對(duì)試驗(yàn)，與T1親和的有37株，其交配型為AyBy；第2 次試驗(yàn)將從第1 輪親和菌株中挑選P8 菌株為T(mén)2（AyBy），進(jìn)行31 組配對(duì)試驗(yàn)，與T2親和的有19 株，其交配型為AxBx；第3 次試驗(yàn)從剩余的既不與T1親和也不與T2親和的菌株中挑選P10菌株為T(mén)3（AxBy），進(jìn)行11 組配對(duì)試驗(yàn)，與T3親和的有3 株，其交配型為AyBx，不親和的有8 株，其交配型為AxBy。以此3 輪交配共進(jìn)行110 組配對(duì)試驗(yàn)，將69 株單核菌株分成4 類(lèi)，結(jié)果如表3 所示。在進(jìn)行配對(duì)試驗(yàn)過(guò)程中，需將單核菌株中生長(zhǎng)速率居中的菌株作為測(cè)交菌株T1、T2和T3，以防止試驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)一方長(zhǎng)得過(guò)快或過(guò)慢而影響配對(duì)試驗(yàn)結(jié)果。

表3 糙皮側(cè)耳單核菌株3輪配對(duì)結(jié)果統(tǒng)計(jì)Tab.3 Statistical results of three rounds of pairing of monokaryon strains from Pleurotus ostreatus

2.4 核遷移試驗(yàn)鑒定結(jié)果

根據(jù)3 輪交配結(jié)果，從T1（AxBx）、T2（AyBy）、T3（AxBy）、T4（AyBx）4 個(gè)類(lèi)型中分別抽取生長(zhǎng)速度一致的單核菌株P(guān)16、P8、P14、P17 做核遷移試驗(yàn)，流程如圖3所示。

由于A 因子控制的是菌絲的融合，B 因子控制核的遷移，所以在一種非標(biāo)準(zhǔn)型四極性的不親和反應(yīng)中，想知道哪一種是A=B≠，哪一種是A≠B=，哪一種是A=B=，就必須進(jìn)行核遷移等補(bǔ)充試驗(yàn)。結(jié)果表明，因P8×P16 為可親和菌株，所以P8 與P16 為A≠B≠，則P8（T2）的交配型為A2B2；P8×P14 未發(fā)生細(xì)胞核的遷移，所以P8 與P14 為A≠B=，則P14（T3）的交配型為A1B2；而P8×P17 發(fā)生了細(xì)胞核的遷移，所以P8 與P17 為A=B≠，則P17（T4）的交配型為A2B1。野生菌株孢子單核體的4 種交配型得到鑒定，如表4所示，說(shuō)明該野生平菇為四極性異宗結(jié)合真菌。

表4 糙皮側(cè)耳單核菌株交配型測(cè)定結(jié)果Tab.4 Determination of mating type of monokaryons strains of Pleurotus ostreatus

2.5 交配型比例χ2檢驗(yàn)結(jié)果

交配型鑒定結(jié)果顯示，采收的野生平菇經(jīng)單孢分離后，其交配型出現(xiàn)了偏分離現(xiàn)象。在獲取的69株單核菌株中，T1、T2、T3、T44 種交配型的比例為20∶37∶9∶3，通過(guò)計(jì)算得知χ2=39.35。檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)際測(cè)得的交配型比例與預(yù)期的1∶1∶1∶1 的比例不相符。

3 結(jié)論與討論

交配型的鑒定一般采用的是單孢分離或原生質(zhì)體單核化等方式獲得單核菌株，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)交法及核遷移試驗(yàn)對(duì)菌種進(jìn)行鑒定[11-16]。本試驗(yàn)在ITS 鑒定的基礎(chǔ)上，通過(guò)以上方法對(duì)野生平菇的69株單核菌株進(jìn)行交配型鑒定，結(jié)果表明，該野生平菇為四極性異宗結(jié)合的糙皮側(cè)耳。

在69 株單核菌株的培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)其菌落形態(tài)大致分成了4 種類(lèi)型，該結(jié)果與對(duì)香菇[25]、靈芝[26]等研究結(jié)果一致。造成菌絲形態(tài)、菌落特征的差異可能與其交配的A、B 控制因子有關(guān)，因?yàn)樵诮慌湫丸b定的常規(guī)程序中，同樣也會(huì)根據(jù)菌落交接處的菌落形態(tài)來(lái)確定其交配類(lèi)型。但是本試驗(yàn)中4種交配類(lèi)型與菌落形態(tài)分類(lèi)并不一致，因此是否可以根據(jù)菌落的形態(tài)來(lái)初步確定其交配型，或者說(shuō)菌落類(lèi)型與交配型之間是否有一定的關(guān)系還有待研究。

本試驗(yàn)中獲得的T1、T2、T3、T44種交配型的比例與孟德?tīng)柕姆蛛x規(guī)律1∶1∶1∶1 不符，實(shí)際比例出現(xiàn)了偏分離現(xiàn)象。林芳燦等[24]對(duì)香菇研究發(fā)現(xiàn)，原生質(zhì)體單核體的交配型比例同樣出現(xiàn)嚴(yán)重的偏分離，且2種交配型的比例相差可達(dá)43∶1。朱朝輝等[27]以香菇為例研究了交配型與單核體再生能力之間的關(guān)系，結(jié)果顯示，不同交配型單核體的再生能力是有差異的，造成比例出現(xiàn)偏差可能與某種交配型的單核體再生能力弱有關(guān)。程水明[28]同樣以香菇為試材，發(fā)現(xiàn)來(lái)自同一雙核菌株F1擔(dān)孢子的菌絲萌發(fā)能力和生長(zhǎng)速度是有差異的，這種差異導(dǎo)致了4種交配型分布不均衡，從而造成偏分離現(xiàn)象的發(fā)生。本研究中，來(lái)自同一野生平菇菌株的69株孢子單核體在菌絲培養(yǎng)階段，同樣出現(xiàn)了菌落形態(tài)、菌絲生長(zhǎng)速度及萌發(fā)能力的差異，而這些現(xiàn)象均有可能導(dǎo)致偏分離現(xiàn)象的發(fā)生。