朱志炎，陳明花，陳 強(qiáng)，田志宏，李建雄

（1. 長(zhǎng)江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025；2. 中國(guó)科學(xué)院 華南植物園，廣東 廣州 510650）

水稻（Oryza sativaL.）是世界主要糧食作物之一[1-2]。水稻生長(zhǎng)期間，植株可能受到稻瘟病菌、紋枯病菌、鐮刀菌和水稻白葉枯病菌等各種病原菌的侵染。紋枯病是由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）引起的水稻三大病害之一，該病可使水稻產(chǎn)量損失10%～30%，嚴(yán)重時(shí)高達(dá)50%[3-5]。防治水稻紋枯病對(duì)保證和提高水稻生產(chǎn)效益具有至關(guān)重要的作用。

化學(xué)藥劑已被廣泛用于許多植物病害的防治，但由于水稻紋枯病的土傳性質(zhì)，它們?cè)诜乐嗡炯y枯病方面的效果較差。此外，考慮到環(huán)境污染和對(duì)人體健康的危害，也不推薦使用化學(xué)品和殺菌劑。使用抗病品種通常被認(rèn)為是防控水稻紋枯病的唯一有效手段[6]，受限于育種技術(shù)和手段，目前尚無有效的抗紋枯病水稻品種可供選擇，僅有Jamine 85、Tetep、特青、明恢63、LSBR 5、LSBR 33 和Pecos 等幾個(gè)基因型對(duì)紋枯病表現(xiàn)出良好的抗性[7]?？紤]到生產(chǎn)上水稻紋枯病防治的迫切需要，利用細(xì)菌或真菌等自然產(chǎn)生的拮抗劑進(jìn)行生物防治以降低發(fā)病率和病害嚴(yán)重度，是一種有吸引力的、環(huán)境友好的方法[8-9]。前人利用多種微生物對(duì)水稻紋枯病進(jìn)行了生物防治試驗(yàn)。NAEIMI 等[8]報(bào)道了哈茨木霉對(duì)立枯絲核菌有拮抗作用，對(duì)水稻紋枯病的防治率為60%；ZHOU 等[9]研究表明，異形胞固氮藍(lán)藻可產(chǎn)生生物活性物質(zhì)抑制水稻紋枯病菌，分泌植物激素促進(jìn)植物生長(zhǎng)，誘導(dǎo)植物抗病，并改善土壤養(yǎng)分含量。雖然生物防治的優(yōu)勢(shì)很多，但防治效果差異很大，這可能主要是由于生物防治所使用的微生物不同所致。

鏈霉菌是生存在土壤中的革蘭氏陽性絲狀細(xì)菌[10]，其絲狀形態(tài)與產(chǎn)孢特性使其能夠在不利的環(huán)境條件下生存。鏈霉菌通過不同的代謝過程產(chǎn)生各種裂解酶，這些酶可以降解不溶性有機(jī)聚合物，如甲殼素和纖維素[11]；此外，鏈霉菌還可產(chǎn)生多種抗生素[12]等次生代謝物，在農(nóng)業(yè)上可用于防治黃瓜霜霉病、草莓白粉病和灰霉病等多種真菌病害；而且，與其他化學(xué)農(nóng)藥相比，鏈霉菌代謝物具有高效低毒的特點(diǎn)[13]。鏈霉菌Sm4-1986 是中國(guó)科學(xué)院華南植物園植物病理研究組前期研究過程中獲得的1株植物根際細(xì)菌，具有廣譜抑菌特性[14]，但其對(duì)水稻紋枯病的防治效果尚不清楚。為進(jìn)一步拓展水稻紋枯病的生防菌資源，測(cè)定了鏈霉菌Sm4-1986 對(duì)水稻紋枯病的防效、其代謝物對(duì)水稻紋枯病病原菌的抑制效果及對(duì)水稻的促生作用，為水稻紋枯病生防菌的基礎(chǔ)研究和開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

鏈霉菌Sm4-1986（Streptomyces morookaensis）[15]由中國(guó)科學(xué)院華南植物園植物病理研究組提供，立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）由長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院惠贈(zèng)，供試水稻品種為中花11。

將鏈霉菌Sm4-1986 從保藏菌種中接種至馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上，28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d 進(jìn)行菌種活化。用直徑5 mm 的打孔器在鏈霉菌Sm4-1986 生長(zhǎng)的PDA 培養(yǎng)基上取20 塊帶有菌絲的瓊脂塊，將瓊脂塊分別接種至20 個(gè)含有400 mL 馬鈴薯葡萄糖液體（PDB）培養(yǎng)基的1 L 錐形瓶中，在恒溫振動(dòng)搖床上200 r/min、28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d，收集鏈霉菌Sm4-1986 發(fā)酵液，保存于4 ℃冰箱內(nèi)待用。

1.2 鏈霉菌Sm4-1986與水稻紋枯病菌的共培養(yǎng)

在PDA 培養(yǎng)基上用共培養(yǎng)技術(shù)測(cè)定鏈霉菌Sm4-1986 對(duì)立枯絲核菌的拮抗作用。取PDA 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)活躍的鏈霉菌Sm4-1986 菌絲塊（直徑5 mm），放入含有PDA 培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿（直徑90 mm）內(nèi)四點(diǎn)上（四點(diǎn)呈正方形），28 ℃培養(yǎng)4 d后，取生長(zhǎng)狀態(tài)活躍的立枯絲核菌菌絲塊放置在培養(yǎng)皿四點(diǎn)中間，28 ℃培養(yǎng)，記錄5 d 后鏈霉菌Sm4-1986 對(duì)立枯絲核菌菌絲生長(zhǎng)的抑制情況[16]。用單獨(dú)在培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)的立枯絲核菌作為對(duì)照1。

將鏈霉菌Sm4-1986 接種到PDB 培養(yǎng)液中，28 ℃、200 r/min 黑暗條件下培養(yǎng)7 d。在雙室塑料無菌培養(yǎng)皿兩側(cè)倒入PDA 培養(yǎng)基，將在PDB 培養(yǎng)液中發(fā)酵培養(yǎng)7 d 的鏈霉菌Sm4-1986 接種于雙室培養(yǎng)皿的一側(cè)，在28 ℃黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；48 h 后取培養(yǎng)7 d 的水稻立枯絲核菌菌絲邊緣的瓊脂塊（直徑5 mm）接種于雙室培養(yǎng)皿另一側(cè)。以無菌水代替鏈霉菌Sm4-1986 培養(yǎng)作為對(duì)照2。雙室培養(yǎng)皿在28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)48 h。用數(shù)碼相機(jī)記錄菌絲體圖像，對(duì)立枯絲核菌直徑進(jìn)行測(cè)量，重復(fù)3次[17]。

1.3 鏈霉菌Sm4-1986的防治效果測(cè)定

1.3.1 離體葉片防效試驗(yàn) 將水稻品種中花11 在溫室內(nèi)種植1 個(gè)月，從主分蘗上取倒二葉葉片切成8 cm 長(zhǎng)的小葉片，放入培養(yǎng)皿（直徑9 cm）內(nèi)濕濾紙上保濕。每個(gè)處理使用3 個(gè)小葉片作為一個(gè)重復(fù)，每處理3 個(gè)重復(fù)。用圓形切割器從PDA 平板上將含有立枯絲核菌的PDA 培養(yǎng)基（直徑5 mm）切下，放在每片葉的背面，25 ℃連續(xù)光照培養(yǎng)72 h，濾紙用無菌水保持濕潤(rùn)。取10 mL 培養(yǎng)7 d 的鏈霉菌Sm4-1986 發(fā)酵液噴施于葉片表面，對(duì)照（CK）用相同體積的無菌水噴施。每隔24 h，測(cè)量每個(gè)葉片上的病斑長(zhǎng)度，并對(duì)每片葉的病害嚴(yán)重度進(jìn)行0～9 級(jí)的目測(cè)評(píng)級(jí)：0 級(jí)表示無病斑，9 級(jí)表示病斑覆蓋90%～100%的葉面，1～8 級(jí)分別代表病葉面積10%～80%[18]。

1.3.2 無菌苗防效試驗(yàn) 在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)水稻種子，發(fā)芽后轉(zhuǎn)移到含有1/2 MS 培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，每瓶3 株，呈直線排列。將直徑5 mm 立枯絲核菌菌絲塊放在水稻幼苗一側(cè)距離水稻幼苗2 cm 處生長(zhǎng)以接種每株植株。培養(yǎng)基接種立枯絲核菌菌絲塊前2 d，在培養(yǎng)基上水稻幼苗另一側(cè)距離水稻幼苗2 cm 處接種直徑5 mm 的鏈霉菌Sm4-1986 菌絲塊，鏈霉菌菌絲塊與立枯絲核菌菌絲塊在一條直徑上，兩者相距4 cm。對(duì)照為在培養(yǎng)基上水稻幼苗另一側(cè)距離水稻幼苗2 cm 處接種空白PDA 培養(yǎng)基瓊脂塊。培養(yǎng)條件為（25±2）℃、光照12 h，培養(yǎng)5 d后記錄每株水稻的病害嚴(yán)重度，統(tǒng)計(jì)無菌苗發(fā)病率、平均病級(jí)、病情指數(shù)及防治效果[19]。病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為，0 級(jí)：健康無病害；1 級(jí)：病斑面積為葉鞘面積的0～25%；3 級(jí)：病斑面積為葉鞘面積的25%～50%；5 級(jí)：病斑面積為葉鞘面積的50%～75%；7 級(jí)：病斑面積為葉鞘面積的75%以上，頂部葉片受到嚴(yán)重侵染；9級(jí)：病斑到達(dá)植株頂部，所有葉片被嚴(yán)重侵染，有些植株枯死。水稻植株發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果計(jì)算公式[20]如下：

水稻植株發(fā)病率＝發(fā)病總株數(shù)/接種總株數(shù)×100%，

病情指數(shù)＝∑（各級(jí)發(fā)病株數(shù)×病級(jí)值）/（總株數(shù)×最高病級(jí)值）×100，

防治效果＝（對(duì)照病情指數(shù)－處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100%。

1.3.3 盆栽防效試驗(yàn) 選取新鮮、粗細(xì)均勻的水稻秸稈，剪成6 cm 的小段放至三角瓶中，高壓滅菌后接種新鮮的水稻紋枯病菌菌絲塊，28 ℃光照培養(yǎng)至水稻秸稈表面長(zhǎng)滿水稻紋枯病菌備用。盆栽水稻生長(zhǎng)至第50 天，取培養(yǎng)7 d 的20 mL 鏈霉菌Sm4-1986 發(fā)酵液均勻噴施到水稻植株上，以無菌水處理為對(duì)照，每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)。室溫下水稻表面晾干后，在每簇水稻植株基部接種1 根長(zhǎng)有紋枯病菌的稻稈，用半透明塑料袋罩住盆栽水稻的底部，留出中上部，28 ℃培養(yǎng)5 d，記錄每株水稻的病害嚴(yán)重度，計(jì)算水稻植株發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果。

1.3.4 大田防效試驗(yàn) 水稻幼苗于2020 年8 月移栽至中國(guó)科學(xué)院華南植物園水稻基地。水稻每個(gè)區(qū)塊中每行種植10 株水稻，共種植10 行，生長(zhǎng)至分蘗期進(jìn)行處理。對(duì)照：水稻莖稈上接種立枯絲核菌；處理：水稻莖稈上接種立枯絲核菌后噴施20 mL/株鏈霉菌Sm4-1986 發(fā)酵液。對(duì)照與處理各重復(fù)3 次。處理后5 d，記錄每株水稻病害嚴(yán)重度，計(jì)算水稻發(fā)病率、病情指數(shù)和防病效果。

1.4 鏈霉菌Sm4-1986對(duì)水稻葉片抗氧化酶活性及丙二醛（MDA）含量的影響

水稻種子發(fā)芽后，移至含有250 mL 1/2 MS營(yíng)養(yǎng)液的水培盆（10 cm×18 cm×3.5 cm）中繼續(xù)生長(zhǎng)，每盆種植60 株水稻幼苗，設(shè)置4 個(gè)處理，其中CK 為噴施40 mL 無菌水，Sm 處理為噴施20 mL 無菌水后再噴施20 mL 鏈霉菌Sm4-1986 發(fā)酵液，Rs 處理為接種20 mL 立枯絲核菌菌液后再噴施20 mL 無菌水，SmRs 處理為接種20 mL 立枯絲核菌菌液后噴施20 mL 鏈霉菌Sm4-1986 發(fā)酵液。每個(gè)處理重復(fù)3次。水培15 d，各處理取0.2 g 水稻葉片置于預(yù)冷研缽中，加入2 mL 50 mmol/L PBS [含1%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和0.2 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA），pH 值7.8]，研磨至漿糊狀，在4 ℃、1 200 r/min 條件下離心30 min，取上清液用于葉片酶活性分析。使用紫外分光光度計(jì)測(cè)量波長(zhǎng)560、470、240 nm 處吸光度，參考文獻(xiàn)[21]計(jì)算超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性，丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸比色法測(cè)定[22]。

1.5 鏈霉菌Sm4-1986中抑菌化合物的篩選

前期研究表明，從鏈霉菌Sm4-1986 PDB 發(fā)酵液中共分離得到13 種化合物[23]。采用菌絲延伸試驗(yàn)定性驗(yàn)證單一化合物對(duì)立枯絲核菌菌絲的影響，具體操作步驟如下：在PDA 培養(yǎng)基中接種少量立枯絲核菌，培養(yǎng)7 d直至產(chǎn)生較多菌絲，用直徑為5 mm的打孔器，在PDA 培養(yǎng)基上取立枯絲核菌菌絲邊緣的瓊脂塊，備用；裁剪若干邊長(zhǎng)1.5 cm 的正方形濾紙片，滅菌；將濾紙片用不同化合物處理后置于PDA 平板上，由于甲醇為13 種化合物的溶劑，故采用甲醇處理的濾紙片作為對(duì)照，做好標(biāo)記，隨后分別在各濾紙片上放入一塊準(zhǔn)備好的立枯絲核菌瓊脂塊，28 ℃培養(yǎng)5 d，觀察不同濾紙片上菌絲生長(zhǎng)的狀態(tài)并拍照[15]。

1.6 6-戊基-2H-吡喃-2-酮（6-PP）對(duì)立枯絲核菌的抑菌試驗(yàn)

采用體外菌絲生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)測(cè)定鏈霉菌Sm4-1986 分離化合物6-PP 對(duì)立枯絲核菌菌絲生長(zhǎng)的影響。用打孔器在PDA 平板上打取培養(yǎng)5 d的立枯絲核菌菌絲邊緣直徑5 mm 的瓊脂塊，放入含不同質(zhì)量濃度[0（CK）、0.05、0.10、0.15、0.20 mg/mL]6-PP的PDA 培養(yǎng)基（培養(yǎng)皿直徑9 cm）中。28 ℃培養(yǎng)5 d后測(cè)量立枯絲核菌菌落直徑。菌絲生長(zhǎng)表示為培養(yǎng)皿中真菌菌落（菌絲體）直徑減去瓊脂塊直徑（5 mm）。抑制率[24]按下式計(jì)算：抑制率=（dc-dt）/dc×100%。式中，dc為CK 菌落直徑，dt為6-PP 處理菌落直徑。

濃度依賴曲線是抑制率（Y軸）相對(duì)于測(cè)試樣品質(zhì)量濃度的lg 值（X軸）。IC50和IC90值分別定義為菌絲生長(zhǎng)抑制率為50%和90%所需的質(zhì)量濃度，表示6-PP 抗立枯絲核菌的活性，并用此方法對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的評(píng)價(jià)。每項(xiàng)測(cè)量包括至少3個(gè)重復(fù)。

用斑點(diǎn)平板法測(cè)定6-PP 對(duì)立枯絲核菌的最低殺菌濃度（MFC）。運(yùn)用96 孔板進(jìn)行最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定試驗(yàn)：用直徑5 mm 的打孔器在培養(yǎng)5 d的立枯絲核菌菌絲邊緣取菌絲塊，將菌絲塊分別放入含有100 μL 不同質(zhì)量濃度（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.2 mg/mL）6-PP 溶 液 的96 孔 板 中，每 孔 加 入5 mg/mL TTC溶液5 μL，28 ℃黑暗培養(yǎng)4 h進(jìn)行顯色反應(yīng)，記錄培養(yǎng)前后顏色變化，將不顯色的6-PP 最低質(zhì)量濃度確定為MIC。處理后將經(jīng)不同質(zhì)量濃度6-PP 處理的菌絲塊放到PDA 平板上，28 ℃培養(yǎng)3 d，將PDA 平板上未觀察到菌絲生長(zhǎng)的質(zhì)量濃度作為MFC[24]。

1.7 6-PP對(duì)水稻幼苗生長(zhǎng)發(fā)育的影響

將6-PP在乙醇中溶解。為了研究6-PP對(duì)水稻生長(zhǎng)的影響，在1/2 MS 培養(yǎng)基中添加不同劑量[0（CK）、0.125、0.5、50、200 μmol/L]6-PP 乙醇溶液，其中CK 加入的乙醇體積與6-PP 最高濃度處理加入的乙醇體積相等，3 次重復(fù)[25]。將水稻種子用95%乙醇表面消毒5 min，20%漂白劑表面消毒7 min，蒸餾水洗滌5 次后，放置在含有不同劑量6-PP的1/2 MS培養(yǎng)基平板上萌發(fā)和生長(zhǎng)，每個(gè)平板播種18粒，平板以與水平平面65°的角度傾斜放置，使根沿著瓊脂表面生長(zhǎng)，并使下胚軸的地上生長(zhǎng)暢通無阻，于植物生長(zhǎng)室[光周期為16 h∶8 h（光∶暗）、光照強(qiáng)度為300 μmol/（m2·s）、溫度為22 ℃][25]培養(yǎng)10 d，取幼苗從根與莖的連接處切開分為莖葉和根兩部分，分別測(cè)定莖葉和根的鮮質(zhì)量以及株高、根長(zhǎng)、側(cè)根數(shù)，并計(jì)算單株總質(zhì)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2007 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和制圖，利用SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 共培養(yǎng)條件下鏈霉菌Sm4-1986對(duì)立枯絲核菌的抑制作用

鏈霉菌Sm4-1986 與立枯絲核菌在PDA 培養(yǎng)基上共同生長(zhǎng)5 d 后，鏈霉菌Sm4-1986 抑制了立枯絲核菌菌絲的生長(zhǎng)，該共培養(yǎng)條件下，立枯絲核菌菌絲抑制率達(dá)67.31%（圖1a、b）。為了研究鏈霉菌Sm4-1986揮發(fā)性有機(jī)化合物（VOCs）對(duì)立枯絲核菌生長(zhǎng)的影響，運(yùn)用共培養(yǎng)系統(tǒng)，將2種微生物分別接種在雙室培養(yǎng)皿的兩側(cè)，共培養(yǎng)48 h 后測(cè)定立枯絲核菌的菌絲直徑（圖1c、d），在這種共培養(yǎng)條件下，立枯絲核菌菌絲生長(zhǎng)抑制率達(dá)88.46%。

2.2 鏈霉菌Sm4-1986對(duì)水稻紋枯病的防治效果

2.2.1 離體葉片防效試驗(yàn) 結(jié)果（表1）表明，噴施鏈霉菌Sm4-1986 發(fā)酵液對(duì)水稻紋枯病有顯著防效（P＜0.05）。噴施后3 d，對(duì)照（CK）水稻紋枯病嚴(yán)重度為3級(jí)，而鏈霉菌Sm4-1986發(fā)酵液處理的水稻葉片病害等級(jí)為0級(jí)；噴施后第5天，對(duì)照（CK）水稻葉片病害嚴(yán)重度為8 級(jí)，葉片黃化、潰爛，而噴施鏈霉菌Sm4-1986 發(fā)酵液的水稻葉片病害嚴(yán)重度只有1級(jí)，病害嚴(yán)重度下降87.50%。

表1 鏈霉菌Sm4-1986發(fā)酵液對(duì)水稻紋枯病菌侵染的影響Tab.1 Effect of Streptomyces Sm4-1986 fermentation broth on rice leaves infected by R.solani in vitro

2.2.2 無菌苗防效試驗(yàn) 結(jié)果（表2）顯示，接種立枯絲核菌5 d 后，水稻植株紋枯病發(fā)病率達(dá)100%，發(fā)病嚴(yán)重，病害嚴(yán)重度達(dá)到5.66 級(jí)，病情指數(shù)達(dá)到62.95，菌絲布滿整個(gè)培養(yǎng)基表面，并且擴(kuò)展到葉部，引起葉部病斑。接種鏈霉菌Sm4-1986 的培養(yǎng)基表面基本無立枯絲核菌菌絲生長(zhǎng)，水稻幼苗生長(zhǎng)正常，未受到立枯絲核菌的影響而發(fā)?。▓D2）。鏈霉菌Sm4-1986 在無菌苗生長(zhǎng)中對(duì)水稻紋枯病的防治效果達(dá)100%。

2.2.3 溫室盆栽防效試驗(yàn) 由表2 可見，接種立枯絲核菌5 d 后，CK 水稻植株發(fā)病率達(dá)81.25%，發(fā)病嚴(yán)重，病害嚴(yán)重度達(dá)到2.31 級(jí)，病情指數(shù)達(dá)到25.69，在葉鞘部接種水稻紋枯病菌的附近區(qū)域，形成長(zhǎng)1～2 cm 的不規(guī)則水漬狀病斑，菌絲擴(kuò)展到葉部，并引起葉部病斑；經(jīng)鏈霉菌Sm4-1986 發(fā)酵液噴施處理的水稻長(zhǎng)勢(shì)良好，病害嚴(yán)重程度低于CK（圖2），發(fā)病率為62.50%，病害嚴(yán)重度僅為0.63，病情指數(shù)為6.94，與CK 差異顯著（P＜0.05），對(duì)水稻紋枯病菌的防治效果為72.98%。

表2 鏈霉菌Sm4-1986對(duì)水稻紋枯病的防治效果Tab.2 Control effect of Streptomyces Sm4-1986 on rice sheath blight

2.2.4 大田防效試驗(yàn) 由表2 可見，水稻植株接種立枯絲核菌5 d 后，CK 發(fā)病率為82.35%，病情指數(shù)達(dá)37.91，病害嚴(yán)重度3.41，在葉鞘接種部位形成不規(guī)則水漬狀病斑（圖2）；經(jīng)鏈霉菌Sm4-1986 發(fā)酵液噴施處理的水稻植株病害嚴(yán)重度低于CK，發(fā)病率為76.47%，病害嚴(yán)重度為1.45，病情指數(shù)為15.03，與CK 均差異顯著（P＜0.05），對(duì)水稻紋枯病菌的防治效果為60.35%。

2.3 鏈霉菌Sm4-1986對(duì)水稻葉片抗氧化酶活性與MDA含量的影響

Rs 處理水稻葉片SOD、CAT 活性與MDA 含量上升，分別較CK 顯著提升82.82%、164.33% 與189.12%（P＜0.05），而POD 活性無顯著變化（圖3）；Sm 處理水稻葉片CAT、SOD、POD 活性以及MDA 含量與對(duì)照無顯著差異；SmRs 處理水稻葉片CAT、SOD、POD 活性與CK 沒有顯著差異，而MDA 含量較CK顯著提高50.15%，較Rs處理顯著降低48.06%。

2.4 鏈霉菌Sm4-1986分離化合物抑制立枯絲核菌菌絲生長(zhǎng)的篩選結(jié)果

從鏈霉菌Sm4-1986 PDB 發(fā)酵液中共分離得到13 種化合物，分別為6-甲氧基-3，4，5，7-甲基脂-3，8-烷（6-methoxy-3，4，5，7-tetramethylisochromane-3，8-doil）、3，4，5，7-三甲基烷-3，6，8-三醇（3，4，5，7-trtramethylisochromane-3，6，8-triol）、鏈霉戊二酰亞胺衍生物（Streptimidone derivative）、橘霉素H2（Citrinin H2）、3-（3′，5′-二羥基-2′4′-甲苯基）丁酮[3-（3′，5′-dihydroxy-2′4′-methylphenyl）butan-2-one]、酚類化合物A（Phenol A）、菌核素C（Sclerotinin C）、橘霉素H1（1-epi-citrinin H1）、橘霉素A（Xerucitrinin A）、二萜化合物（Harziandione）、聚酮（Polyketide）、6-PP、2，4-二羥基-3，5，6-三甲苯（2，4-dihydroxy-3，5，6-trimethylbenzene）[23]。單一化合物對(duì)立枯絲核菌菌絲的抑制效果（圖4）表明，6-PP 對(duì)立枯絲核菌菌絲的生長(zhǎng)具有強(qiáng)烈的抑制作用。

2.5 6-PP對(duì)立枯絲核菌的抑菌特性

體外試驗(yàn)表明，6-PP 對(duì)立枯絲核菌有抑菌作用，MIC 為0.6 mg/mL（圖5A），MFC 為0.6 mg/mL（圖5B）。在PDA 平板上檢測(cè)不同質(zhì)量濃度6-PP 對(duì)立枯絲核菌菌絲生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，在測(cè)試范圍內(nèi)，6-PP以劑量依賴的方式抑制立枯絲核菌的生長(zhǎng)（圖5C）。經(jīng)5 d 培養(yǎng)，6-PP 抑制立枯絲核菌菌絲生 長(zhǎng) 的IC50值 為0.007 3 mg/mL，IC90值 為0.11 mg/mL。抑菌效果測(cè)定表明，6-PP 對(duì)立枯絲核菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用呈劑量依賴性。

2.6 6-PP對(duì)水稻幼苗生長(zhǎng)發(fā)育的影響

由圖6 可見，水稻在添加0.125、0.5 μmol/L 6-PP的培養(yǎng)基平板中生長(zhǎng)10 d后，根長(zhǎng)、株高、莖葉鮮質(zhì)量、根鮮質(zhì)量、單株總質(zhì)量、側(cè)根數(shù)較CK 均明顯增加，以含0.5 μmol/L 6-PP 的培養(yǎng)基平板上水稻幼苗生長(zhǎng)最好，分別較CK 提高81.08%、69.71%、19.42%、95.02%、44.18%、123.37%；50 μmol/L 6-PP處理除根長(zhǎng)與側(cè)根數(shù)較CK顯著提高外，其他性狀無顯著差異；200 μmol/L 6-PP處理不僅沒有增加水稻生物量的積累，反而對(duì)水稻生長(zhǎng)表現(xiàn)出抑制作用。

3 結(jié)論與討論

水稻紋枯病是由立枯絲核菌引起的重要病害，而鏈霉菌是一類有效的農(nóng)用抗生素來源菌，篩選新型有效的抗立枯絲核菌鏈霉菌及其天然化合物對(duì)防治水稻紋枯病具有重要意義[26]。本研究以前期獲得的具有廣譜抑菌特性的鏈霉菌Sm4-1986 為研究對(duì)象，測(cè)定其代謝物與揮發(fā)物對(duì)立枯絲核菌的拮抗作用及對(duì)水稻紋枯病的防效，結(jié)果顯示，鏈霉菌Sm4-1986 的代謝物與揮發(fā)物對(duì)立枯絲核菌生長(zhǎng)均具有抑制作用，共培養(yǎng)條件下抑制率分別為67.31%與88.46%，本試驗(yàn)中揮發(fā)物抑制率更高是由于采用涂布的方法接種鏈霉菌Sm4-1986，培養(yǎng)皿中鏈霉菌Sm4-1986 揮發(fā)物量較大，故抑制率較高；在無菌苗試驗(yàn)、溫室試驗(yàn)及大田試驗(yàn)條件下，鏈霉菌Sm4-1986 對(duì)水稻紋枯病均具有良好防治效果，接種病原菌5 d，防效分別達(dá)100%、72.98%、60.35%。進(jìn)一步對(duì)鏈霉菌Sm4-1986 代謝物中天然化合物進(jìn)行篩選，得到拮抗立枯絲核菌的天然化合物6-PP。試驗(yàn)結(jié)果表明，6-PP 不僅對(duì)立枯絲核菌具有抑制效果，而且在低濃度下對(duì)水稻幼苗具有促生作用，與GARNICA-VERGARA 等[25]在擬南芥中的研究結(jié)果相似。

在植物抗病反應(yīng)中,一些防御酶起著重要的調(diào)控作用，生物酶活性變化一定程度上反映寄主與病原的互作關(guān)系，通常植物通過提高相關(guān)防御酶活性阻擋病原菌的侵染，從而提升自身的抗病性[27]。本研究結(jié)果顯示，水稻幼苗接種立枯絲核菌后，葉片中SOD、CAT 活性升高，MDA 含量增加，而水稻幼苗接種立枯絲核菌后噴施鏈霉菌Sm4-1986 發(fā)酵液，葉片SOD、CAT 活性與CK 差異不顯著，MDA 含量較CK 增加但較Rs 處理降低。以上結(jié)果表明，鏈霉菌Sm4-1986 可以降低立枯絲核菌侵染水稻引起的葉片MDA 含量升高。結(jié)合鏈霉菌Sm4-1986 在PDA培養(yǎng)基上抑制立枯絲核菌菌絲生長(zhǎng)以及離體葉片試驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，鏈霉菌Sm4-1986 通過代謝物直接抑制立枯絲核菌在葉片上的繁殖，從而阻止立枯絲核菌對(duì)于水稻葉片的侵染，其對(duì)水稻紋枯病的防效及對(duì)立枯絲核菌侵染引起的MDA 含量升高的降低作用與ANAND 等[28]利用鏈霉菌S-9 防治樹豆枯萎病的研究結(jié)果一致。

自發(fā)現(xiàn)鏈霉菌屬以來，研究人員從該屬菌株中分離得到多種天然化合物[29]，該類菌最初被作為抗生素產(chǎn)生菌株進(jìn)行分離，分離得到的菌株及其代謝產(chǎn)物具有優(yōu)良的抑菌活性[30]。PARK 等[31]從韓國(guó)成奐湖（Sung hwan）湖泥土中分離得到Streptomyces roseoflavusLS-A24，從該菌發(fā)酵液中獲得的星形孢菌素（Staurosporine）對(duì)辣椒疫病具有抑制活性。YANG 等[32]利用湖北一農(nóng)田分離菌株Streptomycesmicroflavus neau 3Y-3 獲得的2 個(gè)尼莫克?。∟emadectin）類新抗生素具有較強(qiáng)的殺螨、殺線蟲作用。ARASU 等[33]從印度孟加拉灣海洋沉積物中分離得到Streptomycessp.AP-123 菌株，該菌株產(chǎn)生的新型聚酮類化合物具有較強(qiáng)的廣譜抗細(xì)菌、抗真菌活性及細(xì)胞毒性，殺菌活性接近紅霉素。本研究從鏈霉菌Sm4-1986 代謝物中篩選得到拮抗立枯絲核菌的天然化合物6-PP，前人對(duì)于6-PP 的生物防治功能研究主要集中在小麥黃萎病、扁豆枯萎病以及松木真菌病害[34-36]，對(duì)水稻紋枯病防治研究相對(duì)較少。本研究發(fā)現(xiàn)，6-PP不僅對(duì)立枯絲核菌具有良好的拮抗作用，還可以促進(jìn)水稻幼苗的生長(zhǎng)。植物病害防治過程中，對(duì)植物具有促進(jìn)作用且可以防治植物病害的天然化合物具有良好的應(yīng)用前景[37]。在今后工作中，如何促進(jìn)鏈霉菌Sm4-1986 產(chǎn)生6-PP值得進(jìn)一步研究。