張鶴騰，唐銀炳，謝文杰，陸佳偉，汪貝貝，侯雯躋，周曉東，蔣鵬程，于強(qiáng)，張文波，鄒晨

(1. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院普外科，江蘇 鎮(zhèn)江 212002；3. 江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院神經(jīng)外科，江蘇 鎮(zhèn)江 212002)

胃癌死亡率高，是癌癥相關(guān)死亡的第三大常見(jiàn)原因[1]。據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)編制的2018年全球癌癥發(fā)病率和死亡率估算數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，胃癌發(fā)病率為5.7%，死亡率為8.2%[2]。在我國(guó)，胃癌已成為男性第二大(13.5%)常見(jiàn)癌癥及第三大(15.1%)癌癥相關(guān)死亡原因、女性第五大(7.1%)常見(jiàn)癌癥及第二大(11.1%)癌癥相關(guān)死亡原因[3-4]。通常早期胃癌無(wú)明顯癥狀，約80%患者在確診時(shí)已處于進(jìn)展期，早期診斷及治療可以提高50%～70%患者5年生存率[5-6]。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA (long non-coding RNA, lncRNA)是一類(lèi)由不同種類(lèi)的RNA分子組成的不編碼或翻譯任何蛋白質(zhì)的長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的功能性RNA分子，在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平均發(fā)揮重要的基因調(diào)控作用[7]。多種腫瘤的生物學(xué)行為與LncRNA功能失調(diào)密切相關(guān)[8-9]，如LncRNA ELFN1-AS1促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的遷移、侵襲[10]；LincRNA-ROR/miR-145軸通過(guò)靶向ZEB2誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，促進(jìn)肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[11]；LncRNA 91H通過(guò)與IGF2BP2相互作用調(diào)控IGF2表達(dá)，促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)生[12]；在胃癌中LncRNA LOC400043通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路抑制胃癌進(jìn)展[13]；LncRNA-ATB[14]、LncRNA HEIH[15]、LncRNA PVT1[16]均在胃癌中表達(dá)上調(diào)并參與促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡等；LncRNA AL139147．1在胃癌中呈高表達(dá)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖[17]；LncRNA HIF-1α和ANRIL在胃癌組織和患者血漿中均高表達(dá)[18]。

LncRNA SPATA3-AS1是人精子發(fā)生相關(guān)基因SPATA3的反義RNA，定位于染色體2q37.1，長(zhǎng)度為3 526 bp。本課題組通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SPATA3-AS1在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織。為進(jìn)一步研究其在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用，本研究對(duì)80例胃癌及癌旁組織和29例胃癌患者血漿中SPATA3-AS1的表達(dá)進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，隨后行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究SPATA3-AS1對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的影響和潛在機(jī)制。

1 病例和方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2016年4月至2020年6月期間就診于江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院普外科行胃癌根治術(shù)80例患者切除的癌組織與癌旁組織。術(shù)后病理檢查確診胃腺癌診斷，選取距腫瘤最遠(yuǎn)邊緣>5 cm的胃組織為對(duì)照的癌旁組織。其中，男57例，女23例；年齡47～82歲，中位年齡67歲；腫瘤直徑≤5 cm者51例，>5 cm者29例；腫瘤TNM分期Ⅰ～Ⅱ期40例，Ⅲ～Ⅳ期40例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性40例，陽(yáng)性40例。隨機(jī)收集上述29例患者清晨空腹肘正中靜脈血各5 mL，2 000 r/min室溫離心，取500 μL上層血漿于-80 ℃保存?zhèn)溆?。另選擇同期隨機(jī)選取的29例健康體檢者血漿。男23例，女6例；年齡47～77歲，中位年齡63歲；腫瘤直徑≤5 cm者14例，>5 cm者15例；Ⅰ～Ⅱ期10例，Ⅲ～Ⅳ期19例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性10例，陽(yáng)性19例，本研究通過(guò)江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意，所有受試者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑

逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及qRT-PCR試劑盒(海翊圣生物科技有限公司)；FITC-Annexin V 及細(xì)胞凋亡試劑盒(上海通善生物技術(shù)有限公司)；Transwell細(xì)胞遷移板(美國(guó)Corning公司)；RPMI 1640培養(yǎng)液(美國(guó)Thermo Fisher公司)；人胃癌AGS、HGC-27細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)；胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；胰蛋白酶(美國(guó)Amresco公司)；Matrigel基質(zhì)膠(美國(guó)BD公司)；RNA提取試劑盒、Trizol均購(gòu)自上海一基實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)SPATA3-AS1相對(duì)表達(dá)量

按制Trizol試劑說(shuō)明書(shū)，提取標(biāo)本、細(xì)胞及血漿中總RNA，檢測(cè)RNA濃度及純度，參照RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。20 μL PCR反應(yīng)體系：DEPC水8.2 μL、SYBR Premix ExTaqⅡ 10 μL和各0.4 μL上、下游引物、cDNA 1 μL。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，SPATA3-AS1引物系列：上游為5′-CTTAAGGGGTCGCCTGAGTC-3′，下游為5′-GGCAGAAA GAAGCTGCCCTA-3′，以β-肌動(dòng)蛋白作為組織和細(xì)胞的內(nèi)參基因，以U6作為血漿樣本的內(nèi)參基因，以-ΔCt值、-ΔΔCt值法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量；qRT-PCR條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 5 s，55 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。

1.4 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.4.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 細(xì)胞分為si-SPATA3-AS1組及si-NC組。分別在12孔板中接種處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AGS、HGC-27細(xì)胞，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞密度達(dá)60%～80%時(shí)行轉(zhuǎn)染。按說(shuō)明使用Lipofectamine 2000試劑對(duì)AGS及HGC-27胃癌細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每孔加入上述混合液100 μL及1 mL培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待培養(yǎng)48～72 h后回收。si-SPATA3-AS1序列為GCUGCUGGAACUGAAUAAATT，si-NC序列為UUCUCCGAACGUGUCACGUTT。

1.4.2 繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌細(xì)胞增殖水平 繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線：取“1.4.1”轉(zhuǎn)染48 h的AGS、HGC-27細(xì)胞，胰蛋白酶消化并計(jì)數(shù)，每組6個(gè)復(fù)孔，以1×104/孔濃度接種。置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72 h更換一次培養(yǎng)基，光學(xué)顯微鏡下每天計(jì)數(shù)1次取平均值。連續(xù)計(jì)數(shù)5 d后進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)：取“1.4.1”轉(zhuǎn)染48 h的AGS、HGC-27細(xì)胞，胰蛋白酶消化，于6孔板中按103個(gè)/孔細(xì)胞數(shù)接種并置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞增殖情況。培養(yǎng)約10 d后出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的細(xì)胞集落時(shí)，用0.5%結(jié)晶紫染色15 min并拍照及計(jì)數(shù)。

1.4.3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AGS、HGC-27細(xì)胞遷移與侵襲 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：取“1.4.1”轉(zhuǎn)染48 h的AGS、HGC-27細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度約為1×105/mL。在Transwell 小室，上室每孔接種細(xì)胞數(shù)為2×104個(gè)，并在各對(duì)應(yīng)下室中每孔加入等量含血清培養(yǎng)基，孵育24 h；棉簽擦去上室未遷移細(xì)胞，細(xì)胞用0.5%結(jié)晶紫染色15 min并拍照。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：將無(wú)血清培養(yǎng)基與Matrigel按7 ∶1比例混合稀釋?zhuān)挥没|(zhì)膠以50 μL/孔包被Transwell小室底部膜的上室面后放置于24孔板中，培養(yǎng)箱孵育2 h；余步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.4.4 流式細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌細(xì)胞凋亡水平 取“1.4.1”轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞并重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/mL，加入FITC-Annexin V和Propidium iodide試劑，暗箱靜置15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)胃癌細(xì)胞凋亡數(shù)。

1.4.5 qRT-PCR檢測(cè)敲減SPATA3-AS1后腫瘤相關(guān)mRNA表達(dá) 按制Trizol試劑說(shuō)明書(shū)，取“1.4.1”轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞，分別提取RNA后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，其余步驟同“1.3”。采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，引物序列見(jiàn)表1。

表1 腫瘤相關(guān)基因引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 SPATA3-AS1在胃癌組織中表達(dá)及與臨床病理特征分析

qRT-PCR結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，胃癌組織中SPATA3-AS1相對(duì)表達(dá)量明顯上調(diào)(t=2.183，P<0.05)。見(jiàn)圖1。根據(jù)胃癌組織中qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果，取SPATA3-AS1相對(duì)表達(dá)量的中位數(shù)為分界值，將胃癌組織分為SPATA3-AS1高表達(dá)組(n=40)和低表達(dá)組(n=40)。胃癌組織中SPATA3-AS1相對(duì)表達(dá)與胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.007)、TNM分期 (P=0.007)及腫瘤浸潤(rùn)深度(P=0.043)相關(guān)，而與其他因素?zé)o關(guān)(P均>0.05)。見(jiàn)表2。Kaplan-Meier分析顯示，與低表達(dá)組相比，SPATA3-AS1高表達(dá)組患者5年生存率明顯降低(HR=2.292，95%CI：1.143～4.597，P=0.020)。見(jiàn)圖2。

2.2 SPATA3-AS1在血漿中的表達(dá)與臨床意義

與健康體檢者相比，胃癌患者血漿中SPATA3-AS1表達(dá)水平顯著增高(t=4.156，P<0.05)。見(jiàn)圖3。SPATA3-AS1表達(dá)與腫瘤TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P均<0.05)，高表達(dá)者具有較多的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及較高的腫瘤TNM分期。見(jiàn)圖4。此外，利用ROC曲線評(píng)估SPATA3-AS1在血漿中差異表達(dá)的敏感性及特異性，其曲線下面積為0.788，提示該指標(biāo)具有較好的診斷價(jià)值。見(jiàn)圖5。

圖1 胃癌及癌旁組織中SPATA3-AS1表達(dá)水平比較

表2 胃癌患者癌組織中SPATA3-AS1的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

圖2 SPATA3-AS1表達(dá)水平與胃癌患者生存率的相關(guān)性

圖3 胃癌患者與健康者血漿中SPATA3-AS1相對(duì)表達(dá)水平比較(n=29)

圖4 胃癌患者血漿SPATA3-AS1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

圖5 胃癌患者血漿中SPATA3-AS1的ROC曲線

2.3 敲減SPATA3-AS1對(duì)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響

2.3.1 敲減SPATA3-AS1對(duì)細(xì)胞增殖的影響 qRT-PCR結(jié)果顯示，與si-NC組相比，AGS、HGC-27細(xì)胞si-SPATA3-AS1組中SPATA3-AS1表達(dá)明顯降低(P均<0.01)，證實(shí)敲減效果滿意。見(jiàn)圖6。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示，與si-NC 組相比，AGS、HGC-27細(xì)胞中si-SPATA3-AS1組胃癌細(xì)胞數(shù)分別從第3天及第4天明顯減少。見(jiàn)圖7。計(jì)數(shù)及克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，與si-NC 組相比，AGS、HGC-27細(xì)胞中si-SPATA3-AS1組細(xì)胞克隆形成率明顯降低(P均<0.01)，由此表明，敲減SPATA3-AS1抑制AGS、HGC-27細(xì)胞增殖。見(jiàn)圖8。

2.3.2 敲減SPATA3-AS1對(duì)細(xì)胞遷移的影響 Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，與si-NC對(duì)照組相比，AGS、HGC-27細(xì)胞中si-SPATA3-AS1組細(xì)胞遷移能力均顯著降低(t=10.21，11.08，P均<0.01)。見(jiàn)圖9。

2.3.3 敲減SPATA3-AS1對(duì)細(xì)胞侵襲的影響 Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，與si-NC對(duì)照組相比，AGS、HGC-27細(xì)胞中si-SPATA3-AS1組細(xì)胞侵襲能力顯著降低(t=12.88，10.30，P均<0.01)。見(jiàn)圖10。

圖6 qRT-PCR檢測(cè)敲減SPATA3-AS1后 AGS、HGC-27細(xì)胞中SPATA3-AS1的表達(dá)

圖7 敲減SPATA3-AS1后AGS和HGC-27細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

圖8 細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組AGS和HGC-27細(xì)胞增殖

圖9 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AGS和HGC-27細(xì)胞遷移能力

圖10 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AGS和HGC-27細(xì)胞侵襲能力

2.3.4 敲減SPATA3-AS1對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，與si-NC對(duì)照組相比，AGS、HGC-27細(xì)胞si-SPATA3-AS1組細(xì)胞凋亡能力均顯著升高(t=11.07，9.94，P均<0.01)。見(jiàn)圖11。

圖11 流式細(xì)胞儀檢測(cè)AGS和HGC-27細(xì)胞的凋亡

2.4 敲減SPATA3-AS1對(duì)腫瘤相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示，在AGS、HGC-27細(xì)胞株中，與si-NC對(duì)照組相比，si-SPATA3-AS1組EMT相關(guān)標(biāo)志物發(fā)生顯著改變，其中間質(zhì)標(biāo)志物N-cadmRNA顯著下調(diào)，同時(shí)上皮標(biāo)志物E-cadmRNA 顯著上調(diào)，與此同時(shí)轉(zhuǎn)錄因子Twist1、SnailmRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05或<0.01)，而其他相關(guān)基因mRNA表達(dá)無(wú)明顯差異。見(jiàn)圖12。由此提示，SPATA3-AS1可能通過(guò)EMT途徑調(diào)控胃癌的發(fā)生發(fā)展。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，相較于癌旁組織和健康者血漿，SPATA3-AS1在胃癌患者癌組織和血漿中的表達(dá)明顯上調(diào)，且與腫瘤TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。其中，高表達(dá)SPATA3-AS1患者生存率低于低表達(dá)患者，提示SPATA3-AS1可能預(yù)測(cè)胃癌患者遠(yuǎn)期生存率。此外，ROC曲線下面積為0.788，提示SPATA3-AS1作為胃癌診斷指標(biāo)具有較高的價(jià)值。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相比于陰性對(duì)照組，敲減SPATA3-AS1處理后的胃癌細(xì)胞侵襲、遷移、增殖能力均降低但細(xì)胞凋亡增加，說(shuō)明SPATA3-AS1促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展。

a：P<0.01，b：P<0.05，與si-NC組相比

為進(jìn)一步研究SPATA3-AS1 在胃癌細(xì)胞生物學(xué)表型中的調(diào)節(jié)作用，本研究對(duì)腫瘤相關(guān)基因進(jìn)行篩查。qRT-PCR結(jié)果顯示，敲減SPATA3-AS1顯著抑制轉(zhuǎn)錄因子Twist1、SnailmRNA和間質(zhì)標(biāo)志物N-cadmRNA表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)上皮標(biāo)志物E-cadmRNA表達(dá)，提示SPATA3-AS1可能通過(guò)EMT途徑促進(jìn)胃癌細(xì)胞表型惡化。EMT是上皮細(xì)胞獲得間充質(zhì)特征的過(guò)程，對(duì)胚胎發(fā)生、傷口愈合及降低癌細(xì)胞藥物敏感性方面至關(guān)重要[19]。EMT在多種惡性腫瘤形成過(guò)程中促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移及其他惡性生物學(xué)行為。Twist1、Snail、Slug等轉(zhuǎn)錄因子及N-cad、波形蛋白、E-cad等EMT相關(guān)基因的顯著表達(dá)，反映腫瘤細(xì)胞活躍的運(yùn)動(dòng)能力[20]。LncRNA可通過(guò)多種途徑調(diào)控胃癌EMT過(guò)程，如染色質(zhì)修飾[21]、轉(zhuǎn)錄調(diào)控[22]、調(diào)控mRNA[23]等。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，SPATA3-AS1在胃癌細(xì)胞中可能通過(guò)上調(diào)Twist1、Snail、N-cad表達(dá)，下調(diào)E-cad表達(dá)，促進(jìn)上皮源性細(xì)胞失去細(xì)胞極性，細(xì)胞黏附能力下降、遷移運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其具體機(jī)制還待進(jìn)一步研究。本研究后續(xù)擬通過(guò)熒光原位雜交技術(shù)、細(xì)胞質(zhì)核分離實(shí)驗(yàn)進(jìn)行亞細(xì)胞定位，并通過(guò)RNA免疫共沉淀等實(shí)驗(yàn)探討其可能的調(diào)控分子。

綜上所述，SPATA3-AS1在胃癌的EMT過(guò)程中發(fā)揮重要作用進(jìn)而影響胃癌進(jìn)展。其可能通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子Twist1、Snail，進(jìn)而調(diào)控間質(zhì)標(biāo)志物N-cad及上皮標(biāo)志物E-cad表達(dá)，從而調(diào)控胃癌EMT。后續(xù)研究將進(jìn)一步探討SPATA3-AS1、癌基因與 EMT之間的關(guān)系進(jìn)而闡明SPATA3-AS1在胃癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用機(jī)制。