李 玲，劉 毅，趙金玉

（1.獲嘉縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河南 獲嘉 453800；2.河南港陸惠農(nóng)股份有限公司）

1 樣品來源

豬血清（被檢血樣100 份）由豫東、豫西、豫南、豫北等幾個(gè)規(guī)?；i場提供：母豬豬血清25份、哺乳仔豬22 份、保育豬28 份、育肥豬23 份。以上血清均無菌采集于豬耳緣靜脈或者前腔靜脈；將采集血液置于離心機(jī)內(nèi)，3 000 r/min離心5 min后取出，上層血清作為備用。

2 試劑與實(shí)驗(yàn)設(shè)備

豬偽狂犬ELISA 試劑盒，PRV 抗原包被板，標(biāo)準(zhǔn)陽性、陰性血清，HRPO標(biāo)記的抗PRVgE/gB抗體，TMB底物溶液，終止液，洗滌液，樣品稀釋液等。酶標(biāo)檢測儀、YXJ-2 臺式高速離心機(jī)、微量移液器、槍頭、超凈臺等由實(shí)驗(yàn)室提供。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 實(shí)驗(yàn)步驟

此次偽狂犬病抗體檢測采用間接ELISA 法：①加稀釋液，按說明書要求用移液器將血清稀釋液依次加入每個(gè)檢測孔和對照孔中；②加陰陽性對照血清；③將待檢血清用移液器分別吸取100 μl 加入ELISA 板孔中，使用時(shí)記得更換吸頭，用振蕩器震蕩反應(yīng)板中的溶液；④溫育，將反應(yīng)板置于37 ℃溫箱內(nèi)30 min；⑤洗板，把各孔內(nèi)的液體甩干，吸取200 μl 洗滌液將板孔洗滌3～5 次；⑥加酶標(biāo)二抗，在反應(yīng)孔內(nèi)加入50 μl酶標(biāo)抗體（即取即用），然后將反應(yīng)板置于溫箱中37 ℃孵30 min；⑦洗板，將各板孔內(nèi)的液體甩干，吸取200 μl洗滌液將板孔洗滌3～5 次；⑧加底物；⑨終止，在每份反應(yīng)孔中加50 μl HF 液結(jié)束反應(yīng)；⑩讀數(shù)，在630 nm 處測定檢測孔以及對照孔的吸光度值。

3.2 判斷標(biāo)準(zhǔn)

在酶標(biāo)儀上測OD630 nm 值。試驗(yàn)合理的要求是陰性參照孔平均OD630 nm 值與陽性參照孔平均OD630 nm值之差≥0.4。S=樣孔OD630 nm 值，N=陰性參照孔平均OD630 nm 值。若S/N 比率≤0.6，該血樣判為PRV陽性。

若0.6＜S/N≤0.7，該血樣判為疑似。

若S/N>0.7，樣品PRV抗體陰性。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

河南地區(qū)規(guī)?；i場PRV gB抗體水平檢測數(shù)據(jù)結(jié)果見表1至表10。河南地區(qū)規(guī)?；i場PRV gB、gE抗體水平檢測數(shù)據(jù)離散度分析見圖1至圖3。

圖1 河南地區(qū)規(guī)模化豬場不同階段豬群豬偽狂犬gE離散度點(diǎn)狀圖

圖2 河南地區(qū)規(guī)?；i場不同階段豬群豬偽狂犬gB離散度點(diǎn)狀圖

圖3 河南地區(qū)規(guī)模化豬場豬群豬偽狂犬陽性率柱形圖

表1 河南地區(qū)規(guī)?；i場母豬PRV gB抗體水平檢測數(shù)據(jù)

表2 河南省規(guī)模化豬場哺乳仔豬PRV gB抗體水平檢測數(shù)據(jù)

表3 河南省規(guī)?；i場保育豬PRV gB抗體水平檢測數(shù)據(jù)

表4 河南省規(guī)?；i場育肥豬PRV gB抗體水平檢測數(shù)據(jù)

表5 河南省規(guī)?；i場母豬PRV gE抗體水平檢測數(shù)據(jù)

表6 河南省規(guī)模化豬場哺乳仔豬PRV gE抗體水平檢測數(shù)據(jù)

表7 河南省規(guī)?；i場保育豬PRV gE抗體水平檢測數(shù)據(jù)

表8 河南省規(guī)?；i場育肥豬PRV gE抗體水平檢測數(shù)據(jù)

表9 河南地區(qū)1規(guī)模化豬場豬偽狂犬gE野毒抗體水平匯總表

表10 河南地區(qū)1規(guī)?；i場豬偽狂犬gB免疫抗體水平匯總表

從結(jié)果可以看出：河南省規(guī)模化豬場偽狂犬gE野毒抗體陽性率為1%；gB 免疫抗體水平陽性率為93%。其中，母豬gE 陽性率為4%，哺乳仔豬、保育豬和育肥豬gE 抗體均為陰性，OD 均值分別為0.630、0.653、0.750、0.709，離散度分別為0.13、0.11、0.12、0.14；母豬gB陽性率為72%，其他陽性率均為100%，OD 均值分別為0.407、0.169、0.176、0.174，離散度分別為0.71、0.50、0.57、0.79。各階段豬抗體陽性率差異顯著。gE 的離散度結(jié)果無明顯意義，因?yàn)間E抗體陽性表明已經(jīng)受到野毒感染。gB 的離散度結(jié)果越大，表示抗體滴度參差不齊，免疫效果較差；離散度小說明抗體滴度整齊，保護(hù)效果較好。

5 分析與討論

5.1 加強(qiáng)PRV野毒抗體監(jiān)測仍然是現(xiàn)階段河南省內(nèi)偽狂犬病的控制關(guān)鍵

此次調(diào)查中：各個(gè)豬場使用的都是豬偽狂犬gE基因缺失苗來控制PRV。所以，通過PRV gE/gB-ELISA 試劑盒對被檢血清的檢查結(jié)果至關(guān)重要。如果被檢血清中g(shù)E檢測結(jié)果是陽性，證明被檢豬只感染偽狂犬野毒；如果gB抗體是陰性，則說明豬只疫苗免疫抗體不合格，需重新進(jìn)行免疫。

5.2 各個(gè)生產(chǎn)階段豬群野毒抗體陽性率較低：疫苗抗體陽性率比較高

通過各個(gè)生產(chǎn)階段豬群的抗體檢測顯示，每個(gè)階段豬群的偽狂犬野毒抗體陽性率有所不同：母豬抗體陽性率略高，其他階段豬群并無野毒感染，離散度較小，豬群情況整體比較穩(wěn)定。

母豬的感染說明現(xiàn)階段使用的免疫方案并不能控制PRV的感染。第一，現(xiàn)階段的基因缺失苗并不完全能對PRV造成影響。第二，母豬的生命期限比較長，豬群免疫一般會受到母豬身體情況、飼養(yǎng)方案和環(huán)境等影響，導(dǎo)致最終免疫不夠到位。

5.3 河南省內(nèi)PRV感染現(xiàn)象較往年有所減輕

此次檢測結(jié)果顯示：2020年至2021年河南省規(guī)?；i場內(nèi)豬群PRV gE陽性率為1%，較2017年至2019年河南省內(nèi)豬場陽性率而言有了很明顯的降低。說明近年來隨著各地區(qū)豬場偽狂犬防控工作的開始，PRV的感染情況逐年減少；抗體陽性率也有了很大的降低，但是豬群的全面凈化還是需要加強(qiáng)提高。

此次試驗(yàn)說明豬群整體免疫情況較好，PRV 感染現(xiàn)象較輕，河南省內(nèi)總體控制情況較好，但仍存在PRV感染現(xiàn)象。合理利用優(yōu)質(zhì)疫苗，做好免疫計(jì)劃，對日常生物安全做好防治措施，仍然是現(xiàn)階段解決偽狂犬野毒感染的重要舉措。