李 玲，劉 毅，趙金玉

（1.獲嘉縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河南 獲嘉 453800；2.河南港陸惠農(nóng)股份有限公司）

1 樣品來源

豬血清（被檢血樣100 份）由豫東、豫西、豫南、豫北等幾個規(guī)?；i場提供：母豬豬血清25份、哺乳仔豬22 份、保育豬28 份、育肥豬23 份。以上血清均無菌采集于豬耳緣靜脈或者前腔靜脈；將采集血液置于離心機(jī)內(nèi)，3 000 r/min離心5 min后取出，上層血清作為備用。

2 試劑與實(shí)驗(yàn)設(shè)備

豬偽狂犬ELISA 試劑盒，PRV 抗原包被板，標(biāo)準(zhǔn)陽性、陰性血清，HRPO標(biāo)記的抗PRVgE/gB抗體，TMB底物溶液，終止液，洗滌液，樣品稀釋液等。酶標(biāo)檢測儀、YXJ-2 臺式高速離心機(jī)、微量移液器、槍頭、超凈臺等由實(shí)驗(yàn)室提供。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 實(shí)驗(yàn)步驟

此次偽狂犬病抗體檢測采用間接ELISA 法：①加稀釋液，按說明書要求用移液器將血清稀釋液依次加入每個檢測孔和對照孔中；②加陰陽性對照血清；③將待檢血清用移液器分別吸取100 μl 加入ELISA 板孔中，使用時記得更換吸頭，用振蕩器震蕩反應(yīng)板中的溶液；④溫育，將反應(yīng)板置于37 ℃溫箱內(nèi)30 min；⑤洗板，把各孔內(nèi)的液體甩干，吸取200 μl 洗滌液將板孔洗滌3～5 次；⑥加酶標(biāo)二抗，在反應(yīng)孔內(nèi)加入50 μl酶標(biāo)抗體（即取即用），然后將反應(yīng)板置于溫箱中37 ℃孵30 min；⑦洗板，將各板孔內(nèi)的液體甩干，吸取200 μl洗滌液將板孔洗滌3～5 次；⑧加底物；⑨終止，在每份反應(yīng)孔中加50 μl HF 液結(jié)束反應(yīng)；⑩讀數(shù)，在630 nm 處測定檢測孔以及對照孔的吸光度值。

3.2 判斷標(biāo)準(zhǔn)

在酶標(biāo)儀上測OD630 nm 值。試驗(yàn)合理的要求是陰性參照孔平均OD630 nm 值與陽性參照孔平均OD630 nm值之差≥0.4。S=樣孔OD630 nm 值，N=陰性參照孔平均OD630 nm 值。若S/N 比率≤0.6，該血樣判為PRV陽性。

若0.6＜S/N≤0.7，該血樣判為疑似。

若S/N>0.7，樣品PRV抗體陰性。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

河南地區(qū)規(guī)?；i場PRV gB抗體水平檢測數(shù)據(jù)結(jié)果見表1至表10。河南地區(qū)規(guī)模化豬場PRV gB、gE抗體水平檢測數(shù)據(jù)離散度分析見圖1至圖3。

圖1 河南地區(qū)規(guī)?；i場不同階段豬群豬偽狂犬gE離散度點(diǎn)狀圖

圖2 河南地區(qū)規(guī)?；i場不同階段豬群豬偽狂犬gB離散度點(diǎn)狀圖

圖3 河南地區(qū)規(guī)模化豬場豬群豬偽狂犬陽性率柱形圖

表1 河南地區(qū)規(guī)模化豬場母豬PRV gB抗體水平檢測數(shù)據(jù)

表2 河南省規(guī)?；i場哺乳仔豬PRV gB抗體水平檢測數(shù)據(jù)

表3 河南省規(guī)?；i場保育豬PRV gB抗體水平檢測數(shù)據(jù)

表4 河南省規(guī)?；i場育肥豬PRV gB抗體水平檢測數(shù)據(jù)

表5 河南省規(guī)?；i場母豬PRV gE抗體水平檢測數(shù)據(jù)

表6 河南省規(guī)模化豬場哺乳仔豬PRV gE抗體水平檢測數(shù)據(jù)

表7 河南省規(guī)?；i場保育豬PRV gE抗體水平檢測數(shù)據(jù)

表8 河南省規(guī)模化豬場育肥豬PRV gE抗體水平檢測數(shù)據(jù)

表9 河南地區(qū)1規(guī)?；i場豬偽狂犬gE野毒抗體水平匯總表

表10 河南地區(qū)1規(guī)模化豬場豬偽狂犬gB免疫抗體水平匯總表

從結(jié)果可以看出：河南省規(guī)?；i場偽狂犬gE野毒抗體陽性率為1%；gB 免疫抗體水平陽性率為93%。其中，母豬gE 陽性率為4%，哺乳仔豬、保育豬和育肥豬gE 抗體均為陰性，OD 均值分別為0.630、0.653、0.750、0.709，離散度分別為0.13、0.11、0.12、0.14；母豬gB陽性率為72%，其他陽性率均為100%，OD 均值分別為0.407、0.169、0.176、0.174，離散度分別為0.71、0.50、0.57、0.79。各階段豬抗體陽性率差異顯著。gE 的離散度結(jié)果無明顯意義，因?yàn)間E抗體陽性表明已經(jīng)受到野毒感染。gB 的離散度結(jié)果越大，表示抗體滴度參差不齊，免疫效果較差；離散度小說明抗體滴度整齊，保護(hù)效果較好。

5 分析與討論

5.1 加強(qiáng)PRV野毒抗體監(jiān)測仍然是現(xiàn)階段河南省內(nèi)偽狂犬病的控制關(guān)鍵

此次調(diào)查中：各個豬場使用的都是豬偽狂犬gE基因缺失苗來控制PRV。所以，通過PRV gE/gB-ELISA 試劑盒對被檢血清的檢查結(jié)果至關(guān)重要。如果被檢血清中g(shù)E檢測結(jié)果是陽性，證明被檢豬只感染偽狂犬野毒；如果gB抗體是陰性，則說明豬只疫苗免疫抗體不合格，需重新進(jìn)行免疫。

5.2 各個生產(chǎn)階段豬群野毒抗體陽性率較低：疫苗抗體陽性率比較高

通過各個生產(chǎn)階段豬群的抗體檢測顯示，每個階段豬群的偽狂犬野毒抗體陽性率有所不同：母豬抗體陽性率略高，其他階段豬群并無野毒感染，離散度較小，豬群情況整體比較穩(wěn)定。

母豬的感染說明現(xiàn)階段使用的免疫方案并不能控制PRV的感染。第一，現(xiàn)階段的基因缺失苗并不完全能對PRV造成影響。第二，母豬的生命期限比較長，豬群免疫一般會受到母豬身體情況、飼養(yǎng)方案和環(huán)境等影響，導(dǎo)致最終免疫不夠到位。

5.3 河南省內(nèi)PRV感染現(xiàn)象較往年有所減輕

此次檢測結(jié)果顯示：2020年至2021年河南省規(guī)?；i場內(nèi)豬群PRV gE陽性率為1%，較2017年至2019年河南省內(nèi)豬場陽性率而言有了很明顯的降低。說明近年來隨著各地區(qū)豬場偽狂犬防控工作的開始，PRV的感染情況逐年減少；抗體陽性率也有了很大的降低，但是豬群的全面凈化還是需要加強(qiáng)提高。

此次試驗(yàn)說明豬群整體免疫情況較好，PRV 感染現(xiàn)象較輕，河南省內(nèi)總體控制情況較好，但仍存在PRV感染現(xiàn)象。合理利用優(yōu)質(zhì)疫苗，做好免疫計劃，對日常生物安全做好防治措施，仍然是現(xiàn)階段解決偽狂犬野毒感染的重要舉措。