唐一梅，余 雙，陳慶慶，2，秦 蓓，張德柱，王曉茹

(1.西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，藥物研究所，陜西 西安 710021；2.成都醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，四川 成都 610500；3.陜西盤龍藥業(yè)集團股份有限公司，陜西 西安 710025；4.陜西功能食品工程中心有限公司，陜西 西安 710065)

“石菖蒲-丹參”開竅醒腦，活血化瘀，但目前文獻報道的“石菖蒲-丹參”組方多為臨床實踐總結(jié)，對其物質(zhì)基礎(chǔ)的研究報道很少。

鄭曉暉教授課題組研究了使藥冰片[1]、郁金[2]、檀香[3]、丹皮[4]、降香[5]等對君藥丹參藥代動力學(xué)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使藥對君藥具有增效作用。于潔等[6]研究石菖蒲和丹參配伍后，石菖蒲對丹參藥代動力學(xué)的影響。結(jié)果表明，石菖蒲和丹參配伍后，可以促進丹參在大鼠血液中的吸收程度和速度，增加君藥丹參的生物利用度。

離子液體是一種新型的溶劑[7]，具有熱穩(wěn)定性好、蒸氣壓低、溶解能力強、可設(shè)計性等優(yōu)點[8]，已用于有機合成[9-10]、電化學(xué)[11]、生物工程[12]、萃取分離[13-18]等領(lǐng)域。研究以離子液體為輔助溶劑，丹參素、α-細(xì)辛醚為檢測指標(biāo)，干預(yù)使藥中有效成分的提取量，得到的使藥提取液作為溶劑提取分析君藥有效成分提取量的變化。從分子水平上，闡明君藥與使藥配伍之后的物質(zhì)基礎(chǔ)變化是密切相關(guān)的，兩者作用源于有效成分之間存在的相互作用。

1 實驗部分

1.1 原料、試劑與儀器

1-甲基-3-丁基-咪唑溴([BMIM]Br),1-甲基-3-辛基咪唑溴離子液體([OMIM]Br)：自制；六氟磷酸鉀：化學(xué)純，薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司；丹參素對照品：純度≥98%，批號KJ0622CA14，上海源葉生物科技有限公司；α-細(xì)辛醚對照品：純度≥98%，批號R27J7Y1678，上海源葉生物科技有限公司；甲醇：色譜純，美國Fisher公司；甲酸：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；丹參：唇形科植物丹參的干燥根及根莖；石菖蒲：天南星科菖蒲屬石菖蒲的干燥根莖，均經(jīng)西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生藥教研室汪興軍老師鑒定，分別粉碎，過篩(孔內(nèi)徑：250 μm±9.9 μm)，待用。

高效液相色譜儀：G1312B型1260，美國Agilent公司；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：DF-101S型，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；超聲波清洗器：SB-5200DT型，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 供試品溶液的制備

1.2.1.1 丹參提取液的制備

稱取丹參粉末3 g置100 mL圓底燒瓶中，加8倍量的水，浸泡30 min，回流提取2次，每次1.5 h，提取完成后趁熱抽濾，合并濾液；用體積比75%甲醇定容至100 mL，得到提取液樣品；精密移取1.00 mL樣品溶液，用75%甲醇溶液定容至10 mL容量瓶。

稱取丹參粉末3 g置100 mL圓底燒瓶中，加8倍量的水與2.67 mL[BMIM]Br離子液體浸泡30 min，回流提取2次，每次1.5 h，提取完成后趁熱抽濾，合并濾液；濾液加入2.77 g六氟磷酸鉀(KPF6)于40 ℃水浴60 min除去離子液體，離心取上清液定容至100 mL；精密移取1.00 mL樣品溶液，用75%甲醇定容至10 mL容量瓶。

稱取丹參粉末3 g置100 mL圓底燒瓶中，先加入2.67 mL[BMIM]Br離子液體浸泡30 min，再加入8倍量的水，回流提取2次，每次1.5 h，提取完成后趁熱抽濾，合并濾液；濾液加入2.77 g KPF6于40 ℃水浴60 min除去離子液體，離心取上清液定容至100 mL；精密移取1.00 mL樣品溶液，用75%甲醇定容至10 mL容量瓶。

1.2.1.2 石菖蒲提取液的制備

稱取石菖蒲粉末1.5 g置100 mL圓底燒瓶中，加入8倍量的水浸泡2 h，回流提取2 h，提取完成后趁熱抽濾，得石菖蒲水提取液；提取液用75%甲醇定容置50 mL，得石菖蒲水體液供試品溶液。

稱取石菖蒲粉末1.5 g置100 mL圓底燒瓶中，加入8倍量的水與0.6 mL[OMIM]Br離子液體浸泡2 h，回流提取2 h，提取完成后趁熱抽濾；濾液加入0.49 g KPF6于40 ℃水浴60 min除去離子液體，離心取上清液，得石菖蒲離子液體-水提取液；提取液用75%甲醇定容至50 mL的容量瓶，得供試品溶液，得石菖蒲離子液體-水供試品溶液。

稱取石菖蒲粉末1.5 g置100 mL圓底燒瓶中，先加入0.6 mL[OMIM]Br離子液體浸泡2 h，再加入8倍量的水，回流提取2 h，提取完成后趁熱抽濾；濾液加入0.49 g KPF6于40 ℃水浴60 min除去離子液體，離心取上清液，得石菖蒲離子液體(浸泡2 h后)-水提取液；用75%甲醇定容至50 mL的容量瓶，得石菖蒲離子液體(浸泡2 h后)-水供試品溶液。

1.2.1.3 丹參-石菖蒲提取液的制備

按1.2.1.2方法得到的3種石菖蒲提取液補足至固液質(zhì)量比1∶8，加入到3 g丹參中，回流提取2次，每次1.5 h，提取完成后趁熱抽濾，合并濾液，用75%甲醇定容至100 mL，得到丹參-石菖蒲提取液樣品；精密移取1.00 mL樣品溶液，用75%甲醇溶液定容至10 mL容量瓶。

1.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取α-細(xì)辛醚對照品1.0 mg，丹參素對照品5.0 mg用75%甲醇定容至25 mL容量瓶中，得到ρ(α-細(xì)辛醚)=0.04 mg·mL、ρ(丹參素)=0.2 mg·mL-1的混合對照品儲備液。

1.2.3 色譜條件

Agilent HC-C18(4.6×150 mm,5 μm)色譜柱；HPLC分析條件：流動相為甲醇-水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%甲酸)線性梯度洗脫：0～9 min，20∶80；9～12 min，50∶50；12～22 min，70∶30；柱溫：30 ℃；流速：0.8 mL·min-1；進樣量：10 μL；檢測波長：286 nm。

1.4.4 線性范圍

吸取混合對照品儲備液0.50、1.00、1.50、2.00、3.00、4.00 mL用75%甲醇至10 mL容量瓶，得到ρ(丹參素)=5、10、15、20、30、40 μg/mL與ρ(α-細(xì)辛醚)=2、4、6、8、12、16 μg·mL的混合對照品溶液，過0.45 μm微孔濾膜，分別精密吸取10 μL進樣，記錄質(zhì)量濃度和峰面積。以峰面積A為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度c為橫坐標(biāo)進行回歸計算，得丹參素線性回歸方程A=6.0984c-31.5(r=0.994 0)，α-細(xì)辛醚線性回歸方程A=18.939c-18.05(r=0.999)。結(jié)果表明，丹參素在5～40 μg/mL、ρ(石菖蒲)=2～16 μg/mL線性關(guān)系良好。

2 結(jié)果與討論

根據(jù)《中國藥典》2015版附錄《藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則》要求，采用外標(biāo)法測定供試品中待測成分的含量，方法學(xué)考察符合測定要求，結(jié)果見表1。

表1 不同溶劑及提取方式對有效成分得率的影響

2.1 離子液體加入方式對丹參素、α-細(xì)辛醚的影響

以水、離子液體-水為溶劑提取劑時，獲得丹參、石菖蒲供試品溶液分析結(jié)果，見圖1。

不同溶劑體系

由表1、圖1可知，當(dāng)用水-離子液體混合溶劑提取時，丹參素的得率明顯高于水提取的丹參素的得率，石菖蒲中α-細(xì)辛醚的得率也高于水提取的得率，且離子液體浸泡后加水再浸泡后提取，有效成分得率均高于離子液體-水混合浸泡的得率。

離子液體浸泡后加水提取，應(yīng)分2種情況，(1)離子液體浸泡(超聲)后直接加水提??；(2)離子液體浸泡后加水再浸泡。這2種情況結(jié)果不同，純離子液體浸泡目的在于離子液體能夠溶解纖維素、破除細(xì)胞壁，利于有效成分釋放。當(dāng)離子液體溶解了纖維素、破除細(xì)胞壁后，再繼續(xù)用離子液體-水溶劑浸泡，目的是利于有效成分更好轉(zhuǎn)移到溶劑體系中。因此，在一些文獻中出現(xiàn)離子液體浸泡后，提取獲得有效成分反而低于離子液體-水混合后浸泡有效成分的提取得率[19]。

總之，離子液體的加入，有效成分提取得率提高，這與離子液體的獨特屬性有關(guān)，具有很好的傳質(zhì)作用，破壞了植物的細(xì)胞壁，從而加速藥材中有效成分的溶出[20]。

2.2 不同溶劑種類對丹參素以及α-細(xì)辛醚得率的影響

丹參-石菖蒲混合供試品溶液分析結(jié)果，見圖2。

不同溶劑體系

由表1、圖2可知，丹參素的得率在提取劑為水-石菖蒲(離子液體浸泡后加水)提取液的條件下最高，提取劑為水-石菖蒲(離子液體水混合)提取液得率次之，水-石菖蒲提取液進行提取時得率最低。

相反，當(dāng)水-石菖蒲提取液為提取溶劑時所得的混合溶液中α-細(xì)辛醚的得率最高。分析其原因可能由于加入離子液體的石菖蒲提取液再對丹參進行提取時因為要除掉離子液體時進行的40 ℃水浴時導(dǎo)致石菖蒲中揮發(fā)性成分有所損失。

2.3 不同溶劑對丹參素得率的影響

丹參不同提取方式，供試品溶液測試結(jié)果，見圖3。

不同溶劑體系

由圖3可知，當(dāng)提取液中有石菖蒲時，所得的丹參素得率均比沒有石菖蒲有效成分時的得率要高，分析其原因可能由于石菖蒲中的有效成分與丹參素有弱的相互作用，進而導(dǎo)致丹參素的得率增加。由表1可知，α-細(xì)辛醚的量相對減少，可能是石菖蒲中提取液中其他有效成分增加，這些有效成分與丹參素有著弱的相互作用力，從而導(dǎo)致丹參素得率增加。通過研究，表明單一檢測α-細(xì)辛醚的量不足以表明君-使藥對之間的作用機制。石菖蒲的有效成分主要為揮發(fā)性成分，其中一部分溶于水的小分子可能與丹參素有著弱的相互作用力，從而導(dǎo)致丹參素的得率增加。

總之，離子液體作為一種表面活性劑，本身就有著傳統(tǒng)溶劑無法比擬的優(yōu)點，作為綠色溶劑，離子液體能破除細(xì)胞壁，破壞纖維素使有效成分溶出。

君-使藥對構(gòu)成的藥對體系是一個復(fù)雜的物質(zhì)體系，配伍之后之所以能夠產(chǎn)生協(xié)同作用，從化學(xué)的角度分析，這與藥對配伍之后在分子水平上的物質(zhì)基礎(chǔ)變化是密切相關(guān)的，其本質(zhì)原因是君藥和使藥在體內(nèi)各自有組效應(yīng)物質(zhì)，這2組效應(yīng)物質(zhì)之間協(xié)同作用，加上機體的調(diào)和作用，從而起到相應(yīng)的療效。

3 結(jié) 論

研究充分說明石菖蒲中的揮發(fā)性成分可能與丹參素有著弱的相互作用力，這能夠闡明“君-使”對藥引經(jīng)、增效實質(zhì)，為研究復(fù)方配伍規(guī)律的體內(nèi)物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機理，開發(fā)高效創(chuàng)新藥物提供新參考。