孫穎琦, 孟亞軒, 趙心月, 王鳳霞, 甕巧云, 趙治海, 劉穎慧, 袁進(jìn)成

(1.河北北方學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院， 河北 張家口 075000;2.張家口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 河北 張家口 075000)

bHLH(basic/Helix-Loop-Helix)家族具有堿性-螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)，廣泛存在于動(dòng)植物及微生物中[1]，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起重要調(diào)控作用。bHLH轉(zhuǎn)錄因子因含有bHLH結(jié)構(gòu)域而被命名，Murre等[2]1989年首次在動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)。Ludwig 等[3]最先從玉米R(shí)基因中發(fā)現(xiàn)bHLH轉(zhuǎn)錄因子，玉米bHLH轉(zhuǎn)錄因子對(duì)花青素合成起重要作用。有研究表明，擬南芥MfbHLH38通過(guò)提高保水能力，調(diào)節(jié)滲透壓平衡，減少脅迫誘導(dǎo)的氧化損傷，參與ABA依賴的脅迫響應(yīng)途徑，提高擬南芥對(duì)干旱和鹽堿脅迫的耐受性[4]；大麻bHLH基因參與了次生代謝物質(zhì)的合成[5]；在甜橙中多個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子相互作用調(diào)控開(kāi)花、光形態(tài)建成和花色苷合成過(guò)程；在葉、花、果實(shí)和愈傷組織中大多數(shù)CsbHLH基因均有表達(dá)[6]。

谷子(SetariaitalicaL.)具有抗旱、耐瘠薄特性[7]，因其含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素和氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，食用價(jià)值高[8]，谷子秸稈中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，易于被家畜吸收利用，因此谷子是重要的糧飼兼用型作物[9]。谷子全基因組測(cè)序已經(jīng)完成，為后續(xù)生物信息學(xué)挖掘谷子功能基因提供重要支撐[10-11]。近年來(lái)，bHLH基因家族在玉米、擬南芥、番茄多種植物中得到鑒定[12-13]，但關(guān)于谷子bHLH基因家族研究還較少。本研究通過(guò)對(duì)谷子bHLH基因家族進(jìn)行生物信息學(xué)鑒定分析，為進(jìn)一步探索谷子bHLH轉(zhuǎn)錄因子的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 谷子bHLH家族蛋白鑒定和生物信息學(xué)分析

從Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)查找下載bHLH轉(zhuǎn)錄因子蛋白結(jié)構(gòu)域的隱馬模型文件(Pfam號(hào)碼：PF 00010)[14]，通過(guò)Gramene網(wǎng)站里plant Genes基因組獲取Gene stable ID和Transcript stable ID，利用SMART和InterPro軟件對(duì)獲取序列進(jìn)行篩選鑒定并去除冗余，共得到151個(gè)bHLH蛋白序列。通過(guò)Ensemble Plants網(wǎng)站查詢得到染色體位置，開(kāi)放閱讀長(zhǎng)度和外顯子數(shù)量等基因信息[15]。bHLH轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)氨基酸數(shù)量、分子量和理論等電點(diǎn)等理化性質(zhì)用在線軟件ExPASy中ProtParam模塊進(jìn)行分析[16]。

1.2 谷子bHLH轉(zhuǎn)錄因子染色體定位

利用MapChart軟件，將在Ensemble Plants查詢的谷子染色體長(zhǎng)度和谷子bHLH轉(zhuǎn)錄因子位置信息，繪制成bHLH轉(zhuǎn)錄因子染色體定位圖。

1.3 谷子bHLH家族蛋白的系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化樹(shù)分析

使用Clustal W和ProSite在線軟件對(duì)谷子bHLH蛋白結(jié)構(gòu)域位置進(jìn)行序列比對(duì)。利用MEGA 6.0軟件中鄰比法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(Bootstrap=1 000)[17]。通過(guò)上述方法對(duì)短柄櫻桃(PrunuspseudocerasusL.)和水稻(OryzasativaL.)bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，參數(shù)設(shè)定為默認(rèn)值。

1.4 谷子bHLH家族蛋白基序(motif)分析及蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過(guò)MEME軟件對(duì)谷子bHLH轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行蛋白基序預(yù)測(cè)(最小寬度為44，最大寬度為200)，利用Welogo 3軟件分析得出谷子bHLH DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域Motif(Stacks per Line設(shè)置為63)[18]，利用各基因位點(diǎn)出現(xiàn)頻率最高基因組成的保守序列，在SWISS-MODEL網(wǎng)站里預(yù)測(cè)三維模型并獲取螺旋結(jié)構(gòu)，根據(jù)上述方法對(duì)二穗短柄草(BrachypodiumdistachyonL.)、綠豆(VignaradiataL.)和水稻(OryzasativaL.)等蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，用SuperPose Version 1.0軟件對(duì)各物種進(jìn)行比較[19]，分析各物種間蛋白結(jié)構(gòu)差異。

1.5 谷子bHLH轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)模式分析

Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取谷子151個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子在不同誘導(dǎo)下RNA-seq數(shù)據(jù)，包括強(qiáng)光誘導(dǎo)兩周后的葉片、藍(lán)光誘導(dǎo)的地上組織、干旱誘導(dǎo)的根、尿素誘導(dǎo)的根、硝酸誘導(dǎo)的根、正常光誘導(dǎo)的根、黑暗誘導(dǎo)的地上組織、強(qiáng)光誘導(dǎo)一周的芽以及紅光誘導(dǎo)的地上組織，利用TBtools軟件繪制谷子bHLH基因家族表達(dá)模式熱圖[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白鑒定

通過(guò)SMART和InterPro在線軟件對(duì)從Gramene網(wǎng)站里plant Genes 63基因組獲取的Gene stable ID及Transcript stable ID進(jìn)行檢測(cè)鑒定，去除冗余后獲取谷子具有bHLH結(jié)構(gòu)域的基因序列。在谷子基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中共鑒定出151個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子，分別命名為SibHLH1～SibHLH151(表1)。151個(gè)bHLH蛋白序列差異較大，氨基酸長(zhǎng)度從85～776 aa變化，分子量從9.61～80.09 kD變化，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為449～6 920 bp，含有1～13個(gè)外顯子，理論等電點(diǎn)介于4.56～10.09之間。在篩選出來(lái)的151個(gè)bHLH蛋白中，有46個(gè)蛋白的等電點(diǎn)大于7，占30.5%呈弱堿性，只有1個(gè)蛋白(SibHLH 136)為中性，占0.7%，68.9%的bHLH蛋白等電點(diǎn)小于7，大部分呈弱酸性。

表1 谷子bHLH基因家族信息

根據(jù)提供的151個(gè)SibHLH轉(zhuǎn)錄因子在染色體上的起始位置信息，繪制出SibHLH基因染色體定位模式圖(圖1)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在谷子9條染色體上，SibHLH1～SibHLH151在9條染色體上都有分布，SibHLH轉(zhuǎn)錄因子呈不均勻分布，其中5號(hào)染色體分布數(shù)量最多為28個(gè)，9號(hào)染色體上分布最少為4個(gè)。

2.2 谷子bHLH基因家族進(jìn)化樹(shù)分析

利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建谷子bHLH基因家族的進(jìn)化樹(shù)，可將bHLH家族劃分成 18個(gè)亞家族(圖2)。其中，第18亞家族中包含bHLH成員數(shù)量最多，含有15個(gè)，第15亞家族中bHLH轉(zhuǎn)錄因子的成員最少，僅有3個(gè)。根據(jù)谷子bHLH轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可以得出，序列長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)域的位置相似的bHLH蛋白聚集在一起。

2.3 谷子與水稻、短柄櫻桃bHLH蛋白比對(duì)

為更好研究谷子bHLH基因家族進(jìn)化規(guī)律，利用MEGA 6.0軟件對(duì)鑒定谷子bHLH家族的151個(gè)成員、雙子葉植物綱短柄櫻桃bHLH家族的111個(gè)成員和單子葉植物綱水稻的bHLH家族的121個(gè)成員進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)比對(duì)(圖3)。進(jìn)化分析結(jié)果表明，383個(gè)bHLH蛋白劃分為26個(gè)亞家族，其中谷子bHLH蛋白存在于24個(gè)亞家族中。發(fā)現(xiàn)大部分谷子bHLH蛋白與短柄櫻桃、水稻不同亞家族的bHLH蛋白聚集在一起，說(shuō)明不同物種間bHLH具有較高的保守性。有2個(gè)亞家族中不含有谷子bHLH蛋白，這種情況可能是谷子bHLH家族在基因演變過(guò)程中發(fā)生擴(kuò)增或缺失導(dǎo)致的。幾乎所有的谷子bHLH蛋白與水稻bHLH蛋白都聚集在不同的亞家族中，與短柄櫻桃相比，谷子bHLH蛋白與水稻同源性更高。

2.4 谷子bHLH蛋白結(jié)構(gòu)域分析

利用ProSite在線軟件對(duì)谷子bHLH蛋白結(jié)構(gòu)域分析，繪制成結(jié)構(gòu)域示意圖(圖4)。發(fā)現(xiàn)所有谷子bHLH蛋白均含有保守的bHLH DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，SibHLH 23、SibHLH 42、SibHLH 78、SibHLH 90、SibHLH 105、SibHLH 109以及SibHLH 142還具有MYC/MYB結(jié)構(gòu)域。MYC結(jié)構(gòu)域具有一個(gè)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，對(duì)植物根或花的發(fā)育有重要作用[21]，MYC和MYB在擬南芥基因的脫水和脫落酸誘導(dǎo)表達(dá)中都起轉(zhuǎn)錄激活作用[22]。研究還發(fā)現(xiàn)，SibHLH 16含有bHLH蛋白和MYC/MYB蛋白結(jié)構(gòu)域，SibHLH 16的氨基酸序列最長(zhǎng),可能具有更多的遺傳物質(zhì)。

2.5 谷子bHLH蛋白保守序列分析

使用Clustal X軟件對(duì)151個(gè)谷子bHLH基因家族成員保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，利用在線軟件Weblogo 3繪制bHLH蛋白的保守結(jié)構(gòu)域氨基酸位點(diǎn)分布圖(圖5)。結(jié)果顯示，谷子bHLH結(jié)構(gòu)域由60個(gè)左右的氨基酸組成，含有2個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)，大部分bHLH保守域氨基酸成員在堿性氨基酸區(qū)含有典型的H 5-E 9-R 13序列，少數(shù)含有R 8-E 9 序列，這序列對(duì)靶基因與植物bHLH蛋白特異結(jié)合起至關(guān)重要的作用。2個(gè)α-螺旋區(qū)內(nèi)的22位點(diǎn)和48位點(diǎn)的亮氨酸(Leu)高度保守，27位點(diǎn)上的保守結(jié)構(gòu)為脯氨酸(Pro)，對(duì)同源或異源二聚體的形成起一定作用。

利用MEME Suite在線工具對(duì)谷子151個(gè)bHLH家族成員進(jìn)行基序(motif)預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果用TBtools可視化(圖6)，發(fā)現(xiàn)谷子bHLH家族鑒定出10種motifs，用10個(gè)不同顏色來(lái)表示不同的motif，其中 motif 1和 motif 2是谷子bHLH蛋白的保守基序，大部分谷子bHLH家族成員同時(shí)含有motif 1和motif 2，序列SibHLH 105、SibHLH 109和SibHLH 142家族成員的motif最為復(fù)雜，含有4個(gè)不同的motif。

2.6 谷子bHLH蛋白3 D結(jié)構(gòu)解析

通過(guò)SWISS-MODEL在線軟件分析不同物種各基因位點(diǎn)出現(xiàn)頻率最高的保守基序，預(yù)測(cè)不同物種bHLH蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖7)，發(fā)現(xiàn)谷子bHLH蛋白的bHLH 3 D DNA結(jié)構(gòu)域含有2個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)，其他物種bHLH蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋構(gòu)成。利用在線軟件Superpose Version 1.0將不同物種間bHLH蛋白3 D結(jié)構(gòu)域進(jìn)行對(duì)比[23]，可以得出谷子與櫻桃(0.79)、擬南芥(1.08)、二穗短柄草(0.72)、綠豆(1.09)三級(jí)結(jié)構(gòu)差異值，谷子與水稻的三級(jí)結(jié)構(gòu)域差值最小(0.08)，與多物種進(jìn)化樹(shù)分支的聚集情況相似，證明谷子bHLH轉(zhuǎn)錄因子與水稻更同源，二者之間具有最高的親緣關(guān)系，而谷子與大麥的比值(1.78)差距最大。通過(guò)不同物種蛋白3 D結(jié)構(gòu)可以發(fā)現(xiàn)，谷子bHLH蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)與水稻、櫻桃、擬南芥和二穗短柄草更保守，綠豆和大麥之間的三級(jí)結(jié)構(gòu)較為相似。

2.7 谷子bHLH基因表達(dá)分析

從Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取151個(gè)谷子bHLH家族基因在不同誘導(dǎo)條件下和不同組織的RNA-seq數(shù)據(jù)，TBtools將結(jié)果可視化，繪制基因表達(dá)熱圖(圖8)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有的bHLH轉(zhuǎn)錄因子在谷子中組成型表達(dá)，SibHLH 3、SibHLH 10、SibHLH 31、SibHLH 35、SibHLH 37、SibHLH 44、SibHLH 78、SibHLH 80、SibHLH 111、SibHLH 115以及SibHLH 122在強(qiáng)光誘導(dǎo)兩周后的第1片葉至第6片葉、光誘導(dǎo)的根、干旱誘導(dǎo)的根、硝酸誘導(dǎo)的根、尿素誘導(dǎo)的根、強(qiáng)光誘導(dǎo)一周的芽、藍(lán)光誘導(dǎo)的地上組織、黑暗誘導(dǎo)的地上組織以及紅光誘導(dǎo)的地上組織中的表達(dá)量均明顯高于其他基因的表達(dá)量，SibHLH68在干旱誘導(dǎo)的根、光誘導(dǎo)的根、硝酸誘導(dǎo)的根及黑暗誘導(dǎo)的地上組織中高效表達(dá)，其他基因幾乎不表達(dá)(小于1)。SibHLH44在強(qiáng)光誘導(dǎo)兩周后的第1片葉上的表達(dá)量最大，SibHLH31在強(qiáng)光誘導(dǎo)兩周后的第2片葉和第5片葉中表達(dá)量最大，SibHLH80在正常光誘導(dǎo)的根和強(qiáng)光誘導(dǎo)的第1片葉中表達(dá)量最大。受脅迫調(diào)控誘導(dǎo)表達(dá)表明SibHLH基因執(zhí)行更多的功能。

3 討論與結(jié)論

bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族是真核生物中一個(gè)大家族，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、新陳代謝及低溫脅迫等生命過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。苜蓿中鑒定出168個(gè)bHLH基因，蘋果中獲得175個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子，茶樹(shù)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)120個(gè)bHLH家族成員，擬南芥中鑒定出162個(gè)bHLH基因[24-27]，本研究中谷子獲得151個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子，與以上物種數(shù)量相近，說(shuō)明該基因家族在進(jìn)化中沒(méi)有出現(xiàn)大幅度擴(kuò)增現(xiàn)象。染色體定位發(fā)現(xiàn)，谷子bHLH轉(zhuǎn)錄因子呈簇狀分布，大麥、馬鈴薯和綠豆中bHLH轉(zhuǎn)錄因子同樣存在簇狀分布現(xiàn)象[28-29]，bHLH轉(zhuǎn)錄因子在染色體上位置分布不均勻，呈現(xiàn)出2個(gè)或多個(gè)基因聚集在一起形成基因簇。理化性質(zhì)分析得出大部分谷子bHLH轉(zhuǎn)錄因子呈弱酸性，與水稻和擬南芥的結(jié)果相似。

根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，大豆bHLH轉(zhuǎn)錄因子分為24個(gè)亞家族，芒果bHLH蛋白分17個(gè)亞家族，白菜bHLH蛋白分為24個(gè)亞家族[30]。本研究鑒定谷子151個(gè)bHLH蛋白分為18個(gè)亞家族，這與西洋參bHLH蛋白報(bào)道數(shù)量相一致。由系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可以得出，單子葉植物水稻與谷子bHLH轉(zhuǎn)錄因子同源性更高。bHLH轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域中含有典型的H 5-E 9-R13序列，研究者發(fā)現(xiàn)，大豆、黑果枸杞、白菜和桑樹(shù)等植物的bHLH轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域中均含有保守的H 5-E 9-R 13序列，與靶基因的結(jié)合有密切關(guān)系，而HLH區(qū)保守氨基酸殘基對(duì)二聚體的形成具有一定影響。

bHLH轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)階段中發(fā)揮重要作用。bHLH表達(dá)模式研究發(fā)現(xiàn)，所有bHLH轉(zhuǎn)錄因子在谷子不同發(fā)育時(shí)期的各組織中均有表達(dá)，與水稻、大豆、白菜的報(bào)道一致。以上結(jié)果揭示了bHLH轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起調(diào)控作用，以及進(jìn)化關(guān)系相近的成員可能發(fā)揮相似的生理功能以調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育。表明這些基因可能具有不同生物學(xué)功能。近年來(lái)，bHLH轉(zhuǎn)錄因子的研究逐漸成為熱點(diǎn)，但在谷子中研究還不深入。本研究對(duì)谷子中bHLH轉(zhuǎn)錄因子的理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、3 D蛋白結(jié)構(gòu)及表達(dá)模式等進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為bHLH轉(zhuǎn)錄因子在谷子上的表達(dá)調(diào)控和功能的研究提供參考。