姜雨昕， 肖春萍， 孫 金， 武艷雪， 翁麗麗

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)， 吉林 長(zhǎng)春 130117)

ISSR即簡(jiǎn)單重復(fù)序列間分子標(biāo)記，是基于SSR基礎(chǔ)之上迅速發(fā)展起來(lái)的，并廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物居群遺傳學(xué)研究的一項(xiàng)新型DNA分子標(biāo)記技術(shù)[5]，其原理是用錨定的微衛(wèi)星DNA作為引物，并在SSR序列的3′或者5′端加入2～4個(gè)隨機(jī)核苷酸，對(duì)兩側(cè)具有反向排列SSR的DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。ISSR技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性高、多態(tài)性豐富、試驗(yàn)成本低、信息量大、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)[6-7]。近年來(lái)ISSR技術(shù)在遺傳多樣性及親緣性問(wèn)題的研究中已廣泛得到應(yīng)用[8-10]。此項(xiàng)技術(shù)作為物種基因組多態(tài)性的分析，避免了環(huán)境與地理位置的限定，其多態(tài)性較高，獲得的信息量多于RAPD(隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性)DNA分子標(biāo)記技術(shù)，精確程度可與RFLP(限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性)技術(shù)相比較[11-12]。

北蒼術(shù)(Atractylodeschinensis(DC.)Koidz.)為菊科蒼術(shù)屬多年生草本植物，主產(chǎn)于我國(guó)吉林、遼寧、河北、內(nèi)蒙古等地，以其干燥根莖入藥，具有燥濕健脾、祛風(fēng)散寒的功效，主要用于濕阻中焦、脘腹脹滿(mǎn)、風(fēng)寒感冒等癥[1-2]，還具有抗菌抗炎、降血壓、抗腫瘤及保肝利尿等多種藥理作用[3-4]。蒼術(shù)是健脾祛濕的常用藥材，近幾年成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)品種[13]。近年來(lái)，為保護(hù)北蒼術(shù)的野生資源及保障市場(chǎng)需求，對(duì)北蒼術(shù)進(jìn)行相應(yīng)的引種栽培及雜交選育使蒼術(shù)屬植物種質(zhì)資源越來(lái)越復(fù)雜，對(duì)北蒼術(shù)資源親緣關(guān)系進(jìn)行分析，將為北蒼術(shù)的起源、進(jìn)化研究提供理論依據(jù)，也為北蒼術(shù)資源的有效利用及保護(hù)提供理論支撐。中藥材種子種苗作為中藥材產(chǎn)業(yè)鏈的起點(diǎn)，其質(zhì)量在中藥材種植及GAP發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮舉足輕重的作用。鑒于此，采用ISSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)不同地區(qū)的22份北蒼術(shù)種子進(jìn)行遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析，以期為開(kāi)展北蒼術(shù)的分類(lèi)、遺傳與進(jìn)化研究提供了分子學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

北蒼術(shù)種子2019年分別采自陜西、內(nèi)蒙古、河北、遼寧、吉林等省區(qū)，均為人工栽培，采后晾干，除去雜質(zhì)，4 ℃儲(chǔ)藏備用。樣品種質(zhì)名稱(chēng)及來(lái)源見(jiàn)表1。

表1 種質(zhì)信息

1.2 試驗(yàn)試劑與儀器

植物組織基因組DNA抽提試劑盒(生工生物)、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(生工生物)、TaqPlus DNA聚合酶(BBI)、瓊脂糖B(BBI)、PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀(BBI)、高速微量離心機(jī)(生工生物)、電泳儀(北京六一)、凝膠成像系統(tǒng)(上海復(fù)日科技有限公司)、微量分光光度計(jì)(Merinton Instrument,Inc)、測(cè)序儀(ABI,Foster,CA,USA)、4S Red Plus核酸染色劑(BBI)、Gene Ruler DNA Ladder Mix(Thermo Scientific)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1基因組DNA的提取

每份樣品取4～5粒飽滿(mǎn)種子，采用試劑盒法提取樣品DNA，操作方法參考該試劑盒說(shuō)明書(shū)。采用電泳1.5%瓊脂糖，1×TAE電泳緩沖液，110 V，100 mA，20 min，電泳觀(guān)察DNA條帶清晰明亮，無(wú)明顯雜帶，則說(shuō)明DNA完整性較好。-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2引物和最佳退火溫度的篩選

參照加拿大不列顛哥倫比亞大學(xué)(UBC)公布的100條ISSR引物序列，初篩出的25條引物由上海生工生物公司合成，選取不同地區(qū)種子序號(hào)1～5，進(jìn)一步選取10條擴(kuò)增條帶多且清晰的引物用于后續(xù)PCR擴(kuò)增。在PCR儀器上設(shè)置12個(gè)梯度做PCR摸索最理想的退火溫度。

1.3.3ISSR-PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序

擴(kuò)增體系20 μL的PCR反應(yīng)液：10×PCR Buffer 2 μL，引物(50 pmol·μL-1)1 μL，dNTP(10 mmol·L-1)0.4 μL，模板DNA(50 ng·μL-1)1 μL，超純水補(bǔ)足至25.0 μL。

擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，各不同退火溫度1 min，72 ℃ 2 min，40個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。ISSR-PCR反應(yīng)完成后，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其條帶和多態(tài)性，同時(shí)拍照。

1.3.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與遺傳多樣性分析

分析10條引物擴(kuò)增后所獲得的凝膠電泳結(jié)果，有條帶出現(xiàn)的為顯性位點(diǎn)，用“1”表示，無(wú)條帶出現(xiàn)的為隱性位點(diǎn)，用“0”代表。根據(jù)條帶信息建立“1”和“0”矩陣，輸入Excel表格，使用Popgene 1.32軟件分析得到的矩陣，獲取觀(guān)測(cè)等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei’s基因多樣性指數(shù)、遺傳距離和遺傳系數(shù)等信息，進(jìn)行遺傳多樣性的分析。同時(shí)，使用NTsys 2.10 e軟件分析“1”和“0”矩陣，得到UPGMA聚類(lèi)樹(shù)，進(jìn)行聚類(lèi)分析，構(gòu)建22批北蒼術(shù)種子的親緣關(guān)系樹(shù)狀圖。

2 結(jié)果分析

2.1 DNA提取結(jié)果

不同個(gè)體基因組DNA提取后并進(jìn)行凝膠檢測(cè)。盡管各個(gè)材料DNA提取濃度有差別，但其純度均較高，沒(méi)有可見(jiàn)的彌散或雜帶出現(xiàn)，保證了ISSR-PCR試驗(yàn)的成功。

2.2 引物和最佳退火溫度篩選結(jié)果

根據(jù)電泳結(jié)果，從100條引物中篩選出10條譜帶清晰、差異明顯、重復(fù)性和穩(wěn)定性高的引物用于22份北蒼術(shù)種子樣品的PCR擴(kuò)增，引物篩選如圖1～圖6(圖1～圖5為同一引物篩選的電泳圖)，引物名稱(chēng)及序列見(jiàn)表2。

表2 引物名稱(chēng)及序列

2.3 引物擴(kuò)增結(jié)果

結(jié)果表明，ISSR試驗(yàn)共得到了246個(gè)清晰位點(diǎn)，其中224個(gè)位點(diǎn)具有多態(tài)性，總的多態(tài)性比率為91.06%。產(chǎn)物片段大小在200～5 000 bp之間，平均每條引物擴(kuò)增出24條條帶。

2.4 不同個(gè)體間遺傳特征

通過(guò)Popgene l.32遺傳分析計(jì)算可知，22份不同來(lái)源北蒼術(shù)種子的觀(guān)測(cè)等位基因?yàn)?.910 6±0.285 9、有效等位基因數(shù)為1.421 7±0.340 9、Nei’s基因多樣性指數(shù)為0.256 1±0.172 5、Shannon’s信息指數(shù)為0.395 9±0.230 6。

2.5 不同個(gè)體間親緣關(guān)系分析

由表3可知，22份不同來(lái)源北蒼術(shù)種子個(gè)體間Nei’s遺傳距離值在0.153 5～0.563 7變化，其中遺傳距離最小的2個(gè)個(gè)體類(lèi)型是12和13，其遺傳距離僅為0.153 5，遺傳距離最大的個(gè)體為6與12和8與12，遺傳距離可達(dá)0.563 7；不同來(lái)源北蒼術(shù)種質(zhì)資源之間的遺傳相似性系數(shù)為0.569 1～0.857 7，其遺傳相似性系數(shù)值最小為6與12和8與12，其遺傳相似性系數(shù)為0.569 1，遺傳相似系數(shù)值最大的為12和13，其值為0.857 7。綜上表明，無(wú)論基于Nei’s遺傳距離還是遺傳相似系數(shù)，在22個(gè)不同來(lái)源北蒼術(shù)種質(zhì)資源中，親緣關(guān)系最近的是12和13，最遠(yuǎn)的是6與12和8與12。同時(shí)，22份北蒼術(shù)種子樣品的遺傳距離和遺傳相似性系數(shù)均在較大范圍內(nèi)變化，說(shuō)明該22個(gè)個(gè)體之間存在較高的遺傳多樣性，22份北蒼術(shù)種子樣品彼此間遺傳變異較大。

表3 不同北蒼術(shù)個(gè)體間遺傳相似性系數(shù)和遺傳距離矩陣

2.6 聚類(lèi)分析結(jié)果

根據(jù)遺傳相似性進(jìn)行 UPGMA 聚類(lèi)分析，構(gòu)建不同產(chǎn)地北蒼術(shù)種子的親緣關(guān)系樹(shù)狀，見(jiàn)圖7。以遺傳相似系數(shù)0.75為閾值，22份北蒼術(shù)樣品被分成五大類(lèi)，即將22批北蒼術(shù)種子分為五種種質(zhì)來(lái)源，第一類(lèi)包括1、2、5、21；第二類(lèi)包括14、15、16、17、18、19、22；第三類(lèi)包括20；第四類(lèi)包括內(nèi)蒙古5個(gè)產(chǎn)地；第五類(lèi)包括陜西5個(gè)產(chǎn)地。種質(zhì)資源遺傳關(guān)系的相似程度與資源來(lái)源地和栽培環(huán)境具有一定的相關(guān)性[14-15]。同時(shí)同一地區(qū)的種質(zhì)間存在差異，這可能與種質(zhì)的起源進(jìn)化有關(guān)。一個(gè)物種的遺傳多樣性越豐富，變異性越高，資源蘊(yùn)藏量越大，對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力就越強(qiáng)[16]。綜上可知，北蒼術(shù)種子地理位置差異是影響北蒼術(shù)種質(zhì)資源遺傳多樣性的主要因素。

2.7 22批北蒼術(shù)種子指紋圖譜的構(gòu)建

用篩選的10條引物對(duì)不同產(chǎn)地22批北蒼術(shù)種子建立DNA指紋圖譜，通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)6條引物均可單獨(dú)鑒定出22批北蒼術(shù)種子，建立的DNA指紋圖譜可用于22批不同產(chǎn)地北蒼術(shù)種質(zhì)資源的分類(lèi)與鑒定，可為北蒼術(shù)種子分子水平鑒別提供參考依據(jù)。見(jiàn)表4、表5。

表4 引物811，815，834指紋圖譜

3 討 論

ISSR標(biāo)記不僅結(jié)合了RAPD的通用性，具備AFLP的大部分優(yōu)點(diǎn)，多態(tài)性遠(yuǎn)比 RAPD、AFLP、SSR豐富，而且操作快捷、安全性較高、成本較低、試驗(yàn)結(jié)果更穩(wěn)定、試驗(yàn)可重復(fù)性更好[17]。種質(zhì)資源間親緣關(guān)系的分析鑒定是進(jìn)行新品種選育的前提，新品種培育之前須首先明確育種材料間遺傳和親緣關(guān)系[18]。許多學(xué)者都對(duì)茅蒼術(shù)遺傳多樣性做了研究[19-22]，暫無(wú)對(duì)北蒼術(shù)種質(zhì)資源進(jìn)行系統(tǒng)研究。故本試驗(yàn)對(duì)北蒼術(shù)種質(zhì)進(jìn)行研究，探明北蒼術(shù)種質(zhì)資源的遺傳多樣性，并通過(guò)6條引物DNA圖譜區(qū)分了22批北蒼術(shù)種子，對(duì)北蒼術(shù)種子鑒定起到了積極作用，有助于中藥材種子市場(chǎng)的監(jiān)督。