郭樹春，苗紅梅，張艷芳，于海峰，聶 惠，邵 盈，喬慧蕾，牟英男，梁 晨，李素萍

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 芝麻研究中心，河南 鄭州 450002；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院 作物科學(xué)研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝與植保學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010011）

向日葵（Helianthus annuus L.）是菊科向日葵屬的重要特色油料作物，也是一種重要的觀賞植物，向日葵籽還是一種主要的休閑食物[1-2]。向日葵可分為油用向日葵、食用向日葵和觀賞向日葵。向日葵具有耐鹽堿、耐干旱、耐瘠薄、適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)，廣泛地分布在歐洲、亞洲、美洲等地的干旱半干旱地區(qū)，是許多國(guó)家或地區(qū)的主要經(jīng)濟(jì)作物。在我國(guó)，向日葵年種植面積穩(wěn)定在100 萬hm2左右。近年來，在我國(guó)幾代向日葵育種工作者的努力下，已經(jīng)選育出一系列高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)，并適宜本土種植的新品種，如油用向日葵品種“康地108”“內(nèi)葵雜3 號(hào)”，食用向日葵品種“SH363”“JK601”“科陽1 號(hào)”等，我國(guó)自育向日葵種子的市場(chǎng)占有率逐漸增加。然而，由于我國(guó)向日葵種質(zhì)資源遺傳背景相對(duì)狹窄，長(zhǎng)期以來我國(guó)的育種者只是通過傳統(tǒng)的方法（回交、雜交育種等）改良材料或選育新品種，未能從根本上拓寬我國(guó)向日葵的遺傳背景。因此，需要一種新的資源創(chuàng)新手段，從根本上拓寬向日葵的遺傳背景、創(chuàng)新向日葵種植資源以打破我國(guó)向日葵傳統(tǒng)育種遺傳多樣性狹窄的壁壘。

20 世紀(jì)化學(xué)誘變育種被發(fā)明，廣泛地應(yīng)用于不同作物的材料創(chuàng)新。多年的試驗(yàn)證明，甲基磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate，EMS）誘變技術(shù)是一種穩(wěn)定性好、誘變效率較高的技術(shù)。EMS 化學(xué)誘變?cè)硎瞧浔恢参锛?xì)胞吸收后，轉(zhuǎn)變成的缺電子活潑中間產(chǎn)物，并容易與堿基上的N 原子和磷酸基團(tuán)發(fā)生親核取代反應(yīng)，使DNA 發(fā)生突變[3]。相對(duì)于傳統(tǒng)育種技術(shù)或分子育種技術(shù)，該化學(xué)誘變技術(shù)具有使用方便、特異性較強(qiáng)、誘變后代較易穩(wěn)定遺傳、不易對(duì)染色體造成畸變的優(yōu)點(diǎn)?；谝陨显颥F(xiàn)已在擬南芥[4-5]、大豆[6-7]、小麥[8-10]、水稻[11-12]、芝麻[13-14]、亞麻[15]、葫蘆[16]、紅薯[17]、玉米[18]、油菜[19]、番茄[20]等作物上廣泛應(yīng)用，在拓寬作物的遺傳背景、創(chuàng)新作物種植資源中發(fā)揮了重要作用。但誘變向日葵種子使用EMS 方法的研究較少，以航天誘變?yōu)橹鱗21-22]。

向日葵原產(chǎn)地在北美，導(dǎo)致我國(guó)向日葵種質(zhì)資源的遺傳多樣性嚴(yán)重不足，嚴(yán)重影響了我國(guó)向日葵品種產(chǎn)出的質(zhì)量。然而，利用傳統(tǒng)的方法（調(diào)查引種、有性雜交、回交等途徑）對(duì)我國(guó)向日葵種質(zhì)資源的創(chuàng)新，存在創(chuàng)新速度慢、創(chuàng)新動(dòng)力不足等缺陷。因此，開發(fā)一種新的、可靠的向日葵資源創(chuàng)新方法迫在眉睫。2017年，向日葵全基因組信息的破解，標(biāo)志著向日葵材料創(chuàng)新方法正在從傳統(tǒng)選育方法向功能基因組或后基因組學(xué)時(shí)代邁進(jìn)，這給向日葵育種家?guī)砹诵碌臋C(jī)遇，同時(shí)帶來了新的挑戰(zhàn)。在基因組水平觸發(fā)多種向日葵的基因突變可以從中獲取所需的性狀；利用現(xiàn)代化學(xué)誘變加速甲基磺酸乙酯（EMS）誘變，觸發(fā)向日葵基因誘變，并構(gòu)建向日葵突變體庫，結(jié)合現(xiàn)代轉(zhuǎn)錄組、基因組、蛋白組等測(cè)序技術(shù)手段，加快向日葵育種進(jìn)程，EMS 誘變技術(shù)為向日葵資源材料創(chuàng)新提供技術(shù)基礎(chǔ)，為向日葵分子設(shè)計(jì)育種以及抗性、品質(zhì)相關(guān)基因的挖掘提供可靠突變體。在我國(guó)利用EMS 誘變向日葵種子的研究較少，因此，本試驗(yàn)開展了EMS 誘變向日葵突變體篩選，旨在拓寬向日葵種質(zhì)資源多樣性。

1 材料和方法

1.1 材料

選取油用向日葵JK103、S18 和食用向日葵科陽7 號(hào)、巴葵138 為試驗(yàn)材料。

1.2 方法

1.2.1 EMS 溶液配制 0.1 mol/L、pH 值7.4 的PBS磷酸緩沖液配制：稱取十二水合磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）21.8 g、二水合磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）6.08 g，用雙蒸水定容至1 000 mL，將pH 值調(diào)至7.4；在PBS 磷酸緩沖液中加入EMS，配制成0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的EMS 溶液。

1.2.2 選種 選取飽滿度、大小一致且無破損的JK103、S18、巴葵138、科陽7 號(hào)種子各100 粒，設(shè)3 次重復(fù)。

1.2.3 催芽 將種子整齊擺放在鋪有雙層毛巾的塑料盒中（15 cm×20 cm），每盒3 層種子為宜。用噴壺均勻噴灑蒸餾水直至毛巾完全濕潤(rùn)，將塑料方盒置于22～25 ℃培養(yǎng)箱中，光照14 h 條件下催芽，催芽過程中觀察出芽情況。

1.2.4 誘變 選取0（CK）、0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0% 6 個(gè)EMS-磷酸緩沖液濃度梯度和3 個(gè)時(shí)間處理梯度（6、12、24 h)，共計(jì)18 個(gè)處理組合，每組合選取100 粒向日葵種子進(jìn)行處理（3 次重復(fù)）。待幼芽剛剛破殼時(shí)挑選預(yù)發(fā)芽種子用EMS 誘變處理，首先用濾紙吸干種子表面水分，然后將種子置于帶蓋、可密封的器皿中，加入相應(yīng)濃度的EMS 處理液并加蓋密封（此項(xiàng)操作在冰上進(jìn)行，目的是減少EMS 的揮發(fā)），并在器皿上標(biāo)明EMS 濃度和預(yù)處理時(shí)間后，置于轉(zhuǎn)速設(shè)置為110 r/min 的搖床上振蕩。

1.2.5 沖洗 誘變結(jié)束后，將每個(gè)處理的種子裝在小紗袋中，并用標(biāo)簽標(biāo)注種子編號(hào)、誘變時(shí)間等信息，后將小紗袋置于適當(dāng)大小的燒杯中并在流水下沖洗3 h。

1.2.6 播種 用4 層報(bào)紙制作直徑5～6 cm、高約15 cm 的無底圓柱桶種缽，4/5 種缽中裝培養(yǎng)土（營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石= 3∶1 配制培養(yǎng)土），此時(shí)培養(yǎng)土表面距離種缽上邊緣在3～4 cm 為宜，將種缽排列在一個(gè)大小適宜的塑料營(yíng)養(yǎng)方盒中方便澆水；將各處理種子播種在缽中，用培養(yǎng)土將種缽填滿，并在營(yíng)養(yǎng)盒中注入燒開后冷卻的自來水直至種缽表面營(yíng)養(yǎng)土濕潤(rùn)，后將其在日光溫室中培養(yǎng)，7 d 定時(shí)澆水2～3 次，保持種缽表面土壤濕潤(rùn)為宜，播種第2 天后，每天8：00—10：00 統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽情況和幼苗成活情況，連續(xù)統(tǒng)計(jì)8 d。

半致死EMS 濃度：一定濃度一定時(shí)間下，使受試樣品半數(shù)死亡的EMS 劑量。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析 采用Microsoft Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并繪圖，采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度EMS 和誘變時(shí)間對(duì)向日葵種子發(fā)芽勢(shì)的影響

播種后第2 天開始觀察、記錄各品種發(fā)芽數(shù)，發(fā)現(xiàn)油用向日葵種子在播種48 h 后開始破土，而食用向日葵種子稍晚一些，一般在播種48～72 h 后開始破土，多數(shù)向日葵品種在播種4 d 后種子發(fā)芽數(shù)達(dá)到高峰，取種子4 d 時(shí)的發(fā)芽數(shù)計(jì)算發(fā)芽勢(shì)。

由圖1 可知，在處理6 h 條件下，隨著EMS 濃度的增加向日葵種子的發(fā)芽勢(shì)變化不大；但是在處理12、24 h 條件下，隨著EMS 濃度的增加向日葵種子的發(fā)芽勢(shì)顯著（P＜0.05）；食用向日葵種子的發(fā)芽勢(shì)降低的程度較油用向日葵種子明顯；油用向日葵種子在EMS 濃度為1.5%時(shí)，處理時(shí)間超過12 h后，發(fā)芽勢(shì)急劇降至50%以下；而食用向日葵種子EMS 濃度為1.0%時(shí)，處理時(shí)間超過12 h 后，發(fā)芽勢(shì)迅速降至50%以下，巴葵138 對(duì)EMS 誘變反應(yīng)最為敏感。

由圖1 可知，油用向日葵種子對(duì)照（CK）的發(fā)芽勢(shì)高于80%，而食用向日葵種子對(duì)照（CK）的發(fā)芽勢(shì)為70%左右。油用向日葵JK103 種子在EMS 濃度為1.5%、處理時(shí)間為12 h 時(shí)，發(fā)芽勢(shì)近50%；在EMS濃度為2.0%、處理時(shí)間為24 h 條件下，發(fā)芽勢(shì)不足10%，同樣的結(jié)果出現(xiàn)在油用向日葵S18 種子中。在食用向日葵種子中，科陽7 號(hào)在EMS 濃度為1.0%、處理時(shí)間為12 h 時(shí)，發(fā)芽勢(shì)近50%；在EMS 濃度1.0%條件下、處理時(shí)間延長(zhǎng)至24 h 時(shí)，發(fā)芽勢(shì)降低到不足20%，相同EMS 濃度下科陽7 號(hào)對(duì)處理時(shí)間敏感；在EMS 濃度為大于1.5%、處理時(shí)間超過12 h時(shí)科陽7 號(hào)發(fā)芽勢(shì)幾乎為0；巴葵138 對(duì)EMS 濃度和處理時(shí)間都比較敏感。

圖1 不同濃度EMS 溶液和不同誘變時(shí)間對(duì)向日葵種子發(fā)芽勢(shì)的影響

2.2 不同濃度EMS 和誘變時(shí)間對(duì)向日葵種子發(fā)芽率的影響

由圖2 可知，未經(jīng)EMS 處理的種子（CK）發(fā)芽率最高，其中，油用向日葵JK103 和S18 的發(fā)芽率接近100%；食用向日葵科陽7 號(hào)的發(fā)芽率也近100%，巴葵138 的發(fā)芽率平均為90%。用不同濃度EMS 處理后，隨著EMS 濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，各品種的種子發(fā)芽率有不同程度降低。較低濃度EMS（≤0.5%）、6 h 處理對(duì)JK103、S18 種子發(fā)芽率較對(duì)照（CK）影響不顯著（P＞0.05）；巴葵138 的發(fā)芽率與對(duì)照（CK）相比顯著降低（P＜0.05）。在EMS 濃度為1.5%、處理12 h 時(shí)，JK103 和科陽7 號(hào)的發(fā)芽率超過50%，S18 和巴葵138 的發(fā)芽率降到20%以下；當(dāng)處理時(shí)間延長(zhǎng)至24 h 時(shí)，只有JK103 的發(fā)芽率達(dá)到了50%，S18 的發(fā)芽率不到10%，而2 個(gè)食用向日葵品種的種子萌發(fā)能力完全喪失。當(dāng)EMS 濃度增加到2.00%、處理時(shí)間超過12 h 時(shí)，4 個(gè)品種的發(fā)芽率均較對(duì)照（CK）顯著降低（P＜0.05）；當(dāng)處理時(shí)間延長(zhǎng)到24 h 時(shí)，除JK103 還有一定的萌發(fā)能力外，其余3 個(gè)品種種子萌發(fā)能力完全受到抑制。由上述可知，相同EMS 濃度下科陽7 號(hào)對(duì)處理時(shí)間敏感。而在EMS 濃度大于1.5%，處理時(shí)間超過12 h 時(shí)，科陽7 號(hào)發(fā)芽率幾乎為0；巴葵138 對(duì)EMS 濃度和處理時(shí)間都比較敏感。油用向日葵種子較食用向日葵種子對(duì)EMS 耐受性較強(qiáng)。

圖2 不同濃度EMS 溶液和誘變時(shí)間對(duì)向日葵種子發(fā)芽率的影響

2.3 向日葵種子EMS 誘變適宜條件分析

由圖3 可知，JK103 半致死EMS 濃度為1.5%下處理12～24 h；S18 半致死EMS 濃度為1.0%下處理12～24 h；科陽7 號(hào)半致死EMS 濃度為1.5%下處理12 h；巴葵138 半致死EMS 濃度為1.0%下處理6～12 h。在向日葵種子相對(duì)發(fā)芽率最接近50%（半致死濃度）前提下，對(duì)于油用向日葵而言，最佳EMS 誘變條件為：EMS 濃度1.0%～1.5%，處理12～24 h；對(duì)于食用向日葵而言，最佳EMS 誘變條件為：EMS 濃度1.0%～1.5%，處理6～12 h。根據(jù)半致死EMS 誘變確定的適宜誘變條件，油用向日葵EMS 誘變適宜條件為：催芽48 h 后，EMS 溶液濃度1.0%～1.5%，處理12～24 h；食用向日葵EMS 誘變適宜條件為：催芽48～72 h 后，EMS 溶液濃度1.0%～1.5%，處理6～12 h。

圖3 不同濃度EMS 溶液和不同誘變時(shí)間對(duì)各品種相對(duì)發(fā)芽率的影響

3 討論與結(jié)論

EMS 誘變效果主要影響因素有誘變劑濃度、樣品處理時(shí)間、處理材料特性[3，23]。試驗(yàn)證明，作物剛剛萌發(fā)的種子是理想的誘變材料，育種者們已對(duì)許多作物種子的甲基磺酸乙酯（EMS）誘變體系進(jìn)行了優(yōu)化與分析。曹冠男[24]對(duì)4 種小麥用EMS 誘導(dǎo)，并對(duì)其誘導(dǎo)效應(yīng)研究，結(jié)果表明，小麥的EMS 誘變體系為：誘變劑濃度1.0%，誘變時(shí)間8～12 h 為宜；弭寶彬等[25]利用EMS 誘變劑對(duì)冬瓜的種子進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，該作物的最佳EMS 誘變濃度為1.2%、時(shí)間為12 h，在此體系下種子發(fā)芽率為54.67%，成苗率為51.83%，該值接近半致死濃度，可以作為冬瓜EMS 誘變的參考值；王春語等[26]研究認(rèn)為，高粱的最佳EMS 誘變濃度為0.1%；周書棟[27]在辣椒突變體庫構(gòu)建及矮稈突變體篩選與分析中指出：在濃度為1.0%EMS、處理時(shí)間為4 h 條件下，辣椒發(fā)芽率為45.2%，幼苗成活率為40.2%；程蛟文等[23]在苦瓜EMS 誘變中初步認(rèn)為苦瓜種子誘變最佳條件：首先清水處理8 h，其次用1.2%～1.5%誘變劑處理2 h；總之，近年來的研究明確了多種農(nóng)作物種子的EMS誘變劑濃度0.3%～1.5%，誘變時(shí)間0.5～24.0 h，不同作物誘變條件差異較大，可根據(jù)研究結(jié)論設(shè)計(jì)試驗(yàn)，深入研究確定特定作物的最佳誘變體系。與其他誘變方法相比，EMS 誘變具有操作簡(jiǎn)單、方便且突變效率高等特點(diǎn)，在植物新種質(zhì)的創(chuàng)制和突變體庫的構(gòu)建中被廣泛應(yīng)用，但是在向日葵上的研究較少。本研究結(jié)果表明，油用向日葵適宜誘變條件為，清水浸種48 h 后，EMS 溶液濃度1.0%～1.5%，誘變12～14 h；食用向日葵適宜誘變條件為，清水浸種48～72 h 后，EMS 溶液濃度1.0%～1.5%，誘變6～12 h。

上述研究結(jié)果與已報(bào)道的雙子葉作物EMS 誘變條件相比，向日葵種子較耐EMS，引起半致死濃度的起始濃度偏高，在油用向日葵種子中這一現(xiàn)象更加明顯；隨著誘變時(shí)間的延長(zhǎng)，在誘變后期向日葵種子對(duì)EMS 的誘變較為敏感。上述現(xiàn)象與一些種皮較薄的種子（芝麻、小麥、水稻等）正好相反[27]，這可能與向日葵種子種皮厚度、密度和硬度相關(guān)，有待后期試驗(yàn)驗(yàn)證。