胡水，賴(lài)瑢?zhuān)詈窠穑炜杉?，周磊，邵?2,＊

1中山大學(xué)化學(xué)學(xué)院，廣州 510275

2中山大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，廣東 珠海 519082

復(fù)方阿司匹林(APC藥片)是常見(jiàn)的鎮(zhèn)痛消炎藥，其有效成分包括A-乙酰水楊酸，P-非那西丁和C-咖啡因，結(jié)構(gòu)如圖1所示，其中“乙酰水楊酸的合成”和“從茶葉中提取咖啡堿”[1]作為經(jīng)典本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)，常用于培養(yǎng)學(xué)生的基本操作，也有基于這些實(shí)驗(yàn)的教學(xué)改革[2,3]，但對(duì)于非那西丁，卻較少有人提及。薄層色譜在實(shí)際工作中應(yīng)用頻率很高，也是本科教學(xué)重點(diǎn)之一，高效液相色譜是飛速發(fā)展的前沿技術(shù)，功能強(qiáng)大。選擇這兩種色譜作為分析方法，既可以鍛煉學(xué)生的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)技能，又可以讓學(xué)生接觸前沿分析技術(shù)。而進(jìn)行橫向?qū)Ρ鹊脑O(shè)置，有利于學(xué)生更好地理解它們的區(qū)別和各自的優(yōu)缺點(diǎn)，從而更好地在日后科研工作中靈活運(yùn)用這兩種色譜技術(shù)。60兆赫茲的臺(tái)式微型核磁共振波譜不需要超導(dǎo)的配件，儀器價(jià)格較為便宜，可以使學(xué)生獲得直接動(dòng)手操作核磁共振波譜儀的機(jī)會(huì)。本文介紹了非那西丁的制備，并且通過(guò)薄層色譜和高效液相色譜對(duì)市售的APC藥片進(jìn)行分析，與學(xué)生自制的產(chǎn)品進(jìn)行對(duì)比，可以使實(shí)驗(yàn)更貼近實(shí)際，讓學(xué)生體驗(yàn)藥物組分提取、合成和分析這一完整的實(shí)際研究流程，增強(qiáng)其綜合實(shí)驗(yàn)?zāi)芰Α?/p>

圖1 乙酰水楊酸、非那西丁、咖啡因結(jié)構(gòu)式

1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h2>

(1) 了解緩沖體系在可逆反應(yīng)合成中的應(yīng)用。

(2) 掌握重結(jié)晶和離心的實(shí)驗(yàn)操作方法。

(3) 掌握臺(tái)式核磁共振波譜儀的基本操作并運(yùn)用1H-NMR對(duì)有機(jī)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析的方法。

(4) 了解薄層色譜和高效液相色譜的原理以及兩種技術(shù)的區(qū)別與聯(lián)系，掌握有機(jī)化合物的定性與定量分析方法。

2 實(shí)驗(yàn)原理

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)氨基苯乙醚和乙酸酐之間的?；磻?yīng)制備非那西丁。在第一步反應(yīng)中，通過(guò)加入過(guò)量乙酸，將對(duì)氨基苯乙醚轉(zhuǎn)化為乙酸鹽，提高反應(yīng)物溶解度，同時(shí)成鹽后?；磻?yīng)效率提升。由于?；磻?yīng)是可逆反應(yīng)，為了使反應(yīng)正向進(jìn)行，在反應(yīng)第二步中，加入乙酸鈉與體系中的乙酸構(gòu)成緩沖體系，使溶液維持在pH = 4-5的弱酸性環(huán)境中，有利于提高轉(zhuǎn)化率。

3 儀器和試劑

儀器：電磁加熱攪拌器(HS7 control，IKA公司)、核磁共振波譜儀(Spinsolve 60 Carbon，Magritek公司)、離心機(jī)(L3-5K，湖南可成公司)、紫外分析儀(ZF-7，上海嘉鵬公司)、水純化系統(tǒng)(Milli-Q Direct 8，Millipore SAS公司)、高效液相色譜(UltiMate 3000，Thermo Fisher Scientific公司)。

試劑：對(duì)乙酰氨基苯酚(化學(xué)純)，無(wú)水碳酸鉀(化學(xué)純)、碘乙烷(化學(xué)純)、丙酮(化學(xué)純)、氬氣(99.9%)、石油醚(化學(xué)純)、乙酸乙酯(化學(xué)純)、對(duì)氨基苯乙醚(化學(xué)純)、冰乙酸(化學(xué)純)、乙酸酐(化學(xué)純)、乙酸鈉(化學(xué)純)、乙腈(色譜純)、氘代DMSO(美國(guó)CIL公司)、APC藥片(遠(yuǎn)大醫(yī)藥(中國(guó))有限公司)。

4 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

4.1 試驗(yàn)篩選

我們參考了兩種反應(yīng)路線(xiàn)，為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)是否可行，我們?cè)O(shè)計(jì)了一系列實(shí)驗(yàn)方案并進(jìn)行優(yōu)化，并確定最優(yōu)實(shí)驗(yàn)方案。

方案一[4]：以對(duì)乙酰氨基苯酚為原料，反應(yīng)路線(xiàn)如圖2所示，以對(duì)乙酰氨基苯酚:無(wú)水碳酸鉀:碘乙烷=1 : 1.1 : 1.1 (摩爾比)條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以丙酮為溶劑，在氬氣氛圍下保持回流，以石油醚:乙酸乙酯=1 : 1 (體積比)作為展開(kāi)劑，薄層色譜監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程(表1)。由于反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，我們調(diào)整了試劑比例，對(duì)乙酰氨基苯酚:無(wú)水碳酸鉀:碘乙烷=1 : 6 : 4 (摩爾比)，以期待縮短反應(yīng)時(shí)間，但是發(fā)現(xiàn)效果并不理想(表1)，由于此時(shí)無(wú)水碳酸鉀和碘乙烷已經(jīng)較大程度地過(guò)量于對(duì)乙酰氨基苯酚，再進(jìn)一步增大碘乙烷和無(wú)水碳酸鉀比例，對(duì)反應(yīng)速率的影響也不明顯，而且也造成試劑浪費(fèi)，所以我們舍棄了這種教學(xué)方案。

圖2 方案一的反應(yīng)路線(xiàn)

表1 薄層色譜監(jiān)測(cè)的反應(yīng)結(jié)果(1)

方案二[5]：以對(duì)氨基苯乙醚為原料，反應(yīng)路線(xiàn)如圖3所示，以對(duì)氨基苯乙醚:乙酸:乙酸酐=1 : 3 :1.1 (摩爾比)作為初始反應(yīng)條件，石油醚:乙酸乙酯=1 : 1 (體積比)作為展開(kāi)劑，薄層色譜監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，不斷優(yōu)化試劑比例，最終確定以對(duì)氨基苯乙醚:乙酸:乙酸酐= 1 : 1.5 : 1.3 (摩爾比)作為實(shí)驗(yàn)比例(表2)。

圖3 方案二的反應(yīng)路線(xiàn)

表2 薄層色譜監(jiān)測(cè)方案的反應(yīng)結(jié)果(2)

4.2 實(shí)驗(yàn)部分

4.2.1 非那西丁的合成與測(cè)試

在100 mL三頸燒瓶上裝上回流冷凝管，加入對(duì)氨基苯乙醚(1.37 g，0.01 mol)、乙酸(0.90 g，0.015 mol)、水(20 mL)和攪拌子，插入溫度計(jì)，且溫度計(jì)保持在液面以下，40 °C反應(yīng)1 h。升高溫度，向上述溶液中加入乙酸酐(1.33 g，0.013 mol)，以乙酸鈉水溶液(1 mol·L-1)調(diào)節(jié)pH為4-5 (約5 mL)，加熱回流30 min。冷卻至室溫后，析出白色晶體，3000 r·min-1離心5 min促進(jìn)結(jié)晶，抽濾，將粗產(chǎn)品烘干后稱(chēng)量。粗產(chǎn)品用水重結(jié)晶(每克粗產(chǎn)品用約5 mL水)，并加入0.2 g活性炭脫色，用事先預(yù)熱的抽濾瓶和布氏漏斗趁熱過(guò)濾，靜置、冷卻至室溫，析出晶體抽濾，烘干并計(jì)算收率，取5 mg非那西丁溶于0.5 mL氘代DMSO進(jìn)行1H-NMR測(cè)試，并進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。另取非那西丁1 mg溶于3 mL乙腈中，經(jīng)過(guò)0.45 μm尼龍66微孔濾膜后進(jìn)行液相色譜測(cè)試，測(cè)試條件如下：液相色譜柱為Syncronis C18柱，250 × 4.6 mm，柱溫25 °C，流速為1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量為1 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，流動(dòng)相為乙腈:1%乙酸水溶液=1 : 1 (體積比)。

4.2.2 APC藥片的薄層色譜分析

將APC藥片粉末100 mg溶于1.5 mL乙酸乙酯，下層沉淀為淀粉等添加劑，取上清液作為待測(cè)液標(biāo)記為Pill，阿司匹林樣品、非那西丁樣品和咖啡因樣品各20 mg，分別溶于1.5 mL乙酸乙酯。采用乙酸乙酯:石油醚:二氯甲烷:冰乙酸=20 : 5 : 3 : 2 (體積比)為展開(kāi)劑，在254 nm紫外燈下觀察分離效果并計(jì)算Rf值。

4.2.3 APC藥片的高效液相色譜分析

取APC藥片粉末1 mg溶于2 mL乙腈中，阿司匹林樣品、非那西丁樣品和咖啡堿樣品各1 mg溶于3 mL乙腈中，經(jīng)過(guò)0.45 μm尼龍66微孔濾膜后作為待測(cè)樣品，測(cè)試條件與非那西丁相同。取50 mg非那西丁樣品，以乙腈溶于50 mL容量瓶中，定容至刻度線(xiàn)，分別取溶液0、2、5、10和15 mL稀釋至50 mL，以溶液濃度X為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性擬合[6]。

5 結(jié)果與討論

5.1 非那西丁表征

非那西丁的數(shù)據(jù)如下：白色晶體，收率約為60%-70%。1H-NMR (62 MHz, DMSO)：δ9.73 (s, 1H),7.46 (d,J= 9.1 Hz, 2H)，6.83 (d,J= 9.0 Hz, 2H)，3.97 (q,J= 7.0 Hz, 2H)，1.99 (s, 3H)，1.29 (t,J=7.0 Hz, 3H)，如圖4所示，結(jié)果與文獻(xiàn)[7]相符。液相色譜中僅在t= 4.663 min處出現(xiàn)一個(gè)單峰，如圖5所示，結(jié)合1H-NMR可確定產(chǎn)品為非那西丁，且純度非常高，接近于100%。

圖4 非那西丁的1H-NMR

圖5 非那西丁的高效液相色譜圖

5.2 APC藥片分析

薄層色譜中三組分完全分離，各組分Rf值如圖6所示。高效液相色譜中的峰形對(duì)稱(chēng)且相鄰兩峰完全分開(kāi)，各組分保留時(shí)間分別為tC= 2.650 min，tA= 4.163 min，tP= 4.663 min，如圖7所示。溶液濃度與峰面積的關(guān)系見(jiàn)表3，擬合得到的方程為Y= 8.0415X+ 0.0135，R2= 1。APC藥片中非那西丁峰面積為1.1019 mAU·min，計(jì)算得到濃度為0.1353 mg·mL-1，藥片質(zhì)量平均0.53 g，進(jìn)而得出藥片中非那西丁含量為143.4 mg，與說(shuō)明書(shū)中每片含量150 mg相近，證明高效液相色譜可以較好地應(yīng)用于藥物分析等方面[8]。TLC與HPLC都是有效的物質(zhì)分離與鑒定手段，二者均屬于吸附色譜，根據(jù)物質(zhì)的極性不同實(shí)現(xiàn)分離，也都可以調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性改變分離效果。然而二者仍有較多不同，TLC方便、快捷、成本低，預(yù)處理簡(jiǎn)單，可同時(shí)展開(kāi)多組樣品但鑒別能力較差且無(wú)法做定量分析；HPLC準(zhǔn)確性高且可實(shí)現(xiàn)定量分析，但維護(hù)成本較高，實(shí)驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)。

圖6 APC藥片的薄層色譜分析

圖7 APC藥片的高效液相色譜分析

表3 非那西丁溶液濃度與高效液相色譜峰面積關(guān)系

6 結(jié)語(yǔ)

APC藥片及其三組分分析作為經(jīng)典實(shí)驗(yàn)教學(xué)案例，學(xué)生不需花過(guò)多時(shí)間去了解新化合物和新反應(yīng)原理，因此適合基礎(chǔ)操作教學(xué)，同時(shí)也十分適合結(jié)合前沿技術(shù)，整合新的綜合性實(shí)驗(yàn)。本文介紹了非那西丁的兩種合成方法并對(duì)比了優(yōu)劣性，在對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行表征的過(guò)程中，涉及到核磁共振波譜、高效液相色譜等現(xiàn)代分析技術(shù)，將前沿技術(shù)與基礎(chǔ)知識(shí)相結(jié)合，有利于培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)興趣。臺(tái)式核磁目前并沒(méi)有十分普及，若相關(guān)高校不具備條件仍可將超導(dǎo)核磁納入實(shí)驗(yàn)教學(xué)。本實(shí)驗(yàn)用時(shí)6-7 h，由于教學(xué)時(shí)長(zhǎng)限制，乙酰水楊酸與咖啡因的定量分析實(shí)驗(yàn)不再重復(fù)，本實(shí)驗(yàn)綜合性較強(qiáng)適合針對(duì)化學(xué)或藥學(xué)專(zhuān)業(yè)的綜合有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)開(kāi)設(shè)，學(xué)生單人進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，課前需要了解TLC與HPLC的區(qū)別與聯(lián)系，引導(dǎo)學(xué)生課前查閱有關(guān)資料，加強(qiáng)學(xué)生理論與實(shí)際相結(jié)合的能力。