吳 悠，賴云菲，趙海霞，董 霽，徐新萍，趙 黎，張 靜，王 惠，姚斌偉，王浩宇，彭瑞云

(軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所,北京 100850)

0 引言

微波是指300 MHz～300 GHz的電磁波。隨著工業(yè)、軍事等領(lǐng)域的發(fā)展，微波已被廣泛應(yīng)用于生活的各個方面。腦是微波輻射最敏感的靶器官之一。既往研究表明，一定劑量的微波輻射可導(dǎo)致大鼠記憶功能下降[1-3]。識別記憶是識別與回憶的集合，主要包含兩種主觀體驗：一種是熟悉感; 另一種是回憶。識別記憶是人類和動物辨認(rèn)熟悉與陌生事務(wù)，降低后續(xù)學(xué)習(xí)成本的重要認(rèn)知功能[4]。然而，既往研究主要關(guān)注微波輻射對空間學(xué)習(xí)和記憶功能的影響[5]，針對連續(xù)高強度微波輻射對大鼠識別記憶的影響及相關(guān)腦組織結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的研究尚未見報道。

本研究采用新物體識別(novel object recognition, NOR)實驗范式檢測連續(xù)高強度微波輻射后大鼠識別記憶功能的改變。同時，采用蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色和尼氏體染色方法檢測定性及定量地對微波輻射后大鼠海馬神經(jīng)元組織結(jié)構(gòu)以及功能狀態(tài)進(jìn)行檢測和評估，以期為連續(xù)高強度微波輻射致識別記憶功能損傷的診斷和防治方法的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

本研究使用36只9周齡雄性Wistar大鼠(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，中國)，體重220～240 g，隨機分為2組：對照組(sham組)和輻射組(exposure組)，每組18只。動物飼養(yǎng)期間可以自由的獲取水和食物，飼養(yǎng)溫度22～25℃，濕度40%～55%，時間控制為12 h光照/12 h黑暗，光照時間早9:00—晚9:00，黑暗時間晚9:00至早9:00。行為學(xué)檢測在光照時間的中間時段進(jìn)行。所有動物在實驗前均獲得了充足的休息。所有實驗均遵循實驗動物倫理標(biāo)準(zhǔn)指南，盡量減少動物的痛苦并減少使用動物的數(shù)量。

1.2 微波輻射方法

將大鼠固定在有機玻璃盒中。采用微波輻射源對大鼠進(jìn)行全身均勻輻射。輻射期間將大鼠裝進(jìn)圓形輻射盒內(nèi)，頭部朝向輻射源中心。每天輻射時長30 min/d共5 d，輻射平均功率密度為50 mW/cm2。對照組不接受微波輻射，其余控制條件與輻射組相同。

1.3 新物體識別測試

使用新物體識別的實驗范式測量大鼠的識別記憶。在輻射前1 d、輻射后1 d兩個時間點進(jìn)行測量。新物體識別曠場大小為50 cm×50 cm×40 cm，每只動物實驗前允許在曠場內(nèi)自由探索10 min以適應(yīng)環(huán)境，保證其實驗時不會因緊張而影響識別。新物體識別測試分為學(xué)習(xí)階段和測試階段，每個階段均為5 min，學(xué)習(xí)階段在曠場內(nèi)左右對稱位置放置兩個完全相同的物體，測試階段將其中一個物體換成大小相近形狀完全不同的物體。使用行為學(xué)實驗軟件Anymaze(Stoelting, USA)進(jìn)行動物行為記錄和數(shù)據(jù)記錄。共記錄測試階段的移動距離、平均速度和辨別指數(shù)(discrimination index, DI:DI=TN/(TN+TF)，其中TN為大鼠探索新物體時間，TF為大鼠探索舊物體時間)。

1.4 大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)觀察

各組大鼠于微波輻射5 d后，用1%的戊巴比妥鈉麻醉后斷頭處死，將腦部完整取出后放置于冰盒上，取右腦部分放入福爾馬林中固定兩周。固定完成后，取海馬部分最大面，沿海馬方向切成厚度約0.5 cm的腦組織放入包埋盒中。將腦組織用流水沖洗12 h后放入自動脫水機中進(jìn)行脫水、透明和浸蠟。將脫水完成的腦組織進(jìn)行石蠟包埋，并修剪成一致大小。將腦組織放在石蠟切片機上切成3 μm厚度的切片，將切片平鋪于載玻片上，置于60℃恒溫箱內(nèi)干燥過夜。將制備好的切片放入不同濃度梯度的酒精中浸泡脫臘，脫臘完成后放在溫水中保持。按順序分別放在蘇木素染液浸泡12 min，伊紅染液浸泡 3 min。染色完成后按順序放置于不同濃度梯度的酒精和二甲苯中脫水。脫水完成后使用中性樹脂封片并使用光學(xué)顯微鏡觀察。

1.5 大鼠海馬組織神經(jīng)元尼氏體染色和定量分析

取微波輻射后5 d的海馬組織切片脫臘完成后放在溫水中保持(同HE染色)。將切片放入甲苯胺藍(lán)染液中染色10 min，然后在95%酒精中分化3 s，梯度乙醇和二甲苯脫水后，用中性樹膠封片。染色完成后使用電子顯微鏡觀察并拍照記錄。將拍攝的海馬區(qū)尼氏體圖像使用Image-Pro Plus軟件(Media Cybernetics, USA)進(jìn)行平均光密度(mean optical density, MOD)定量分析。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 22.0軟件(IBM, America)進(jìn)行獨立樣本T檢驗，使用箱須圖法剔除異常數(shù)據(jù)。文中數(shù)據(jù)均以平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差(standard deviation, SD)表述，使用P值比較組間差異，置信區(qū)間95%，P<0.05被認(rèn)為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 大鼠微波輻射前后體重變化

大鼠微波輻射前后體重如圖1A和1B所示。微波輻射前，輻射組和對照組大鼠體重相近，無明顯差異。微波輻射5 d后，輻射組與對照組體重?zé)o顯著差異。

圖1 微波輻射前后對照組和輻射組大鼠體重比較A：微波輻射前對照組和輻射組大鼠體重；B：微波輻射后對照組和輻射組大鼠體重

2.2 微波輻射后大鼠識別記憶能力降低

微波輻射后新物體識別時各組大鼠移動距離如圖2A所示，輻射組大鼠移動距離顯著低于對照組(n=18,P<0.05)。電磁輻射后新物體識別時各組大鼠平均速度如圖2B所示，輻射組大鼠平均速度顯著低于對照組(n=18,P<0.05)。電磁輻射后新物體識別時各組大鼠辨別指數(shù)如圖2C所示，輻射組大鼠辨別指數(shù)顯著低于對照組(n=18,P<0.05)。

圖2 微波輻射后新物體識別實驗對照組和輻射組大鼠移動距離、平均速度、辨別指數(shù)比較A：微波輻射后對照組和輻射組大鼠移動距離；B：微波輻射后對照組和輻射組大鼠平均速度；C：微波輻射后對照組和輻射組大鼠辨別指數(shù)。*示P<0. 05

2.3 微波輻射后大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)損傷

通過光學(xué)顯微鏡觀察可見，對照組大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)元排列整齊，胞質(zhì)均勻(圖3A和圖3C)。微波輻射組大鼠海馬組織損傷明顯，主要表現(xiàn)為神經(jīng)元核固縮、深染，以CA3區(qū)最為明顯(圖3B和3D)。

圖3 微波輻射后對照組和輻射組大鼠海馬組織HE染色結(jié)果比較A：微波輻射后對照組大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)(Scale bar= 100 μm)；B：微波輻射后輻射組大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)(Scale bar= 100 μm)；C：微波輻射后對照組大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)(Scale bar= 50 μm)；D：微波輻射后輻射組大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)(Scale bar= 50 μm)

2.4 大鼠海馬組織神經(jīng)元尼氏體含量變化

對照組大鼠海馬神經(jīng)元尼氏體含量豐富(圖4A和圖4C)，輻射組大鼠海馬神經(jīng)元尼氏體含量明顯減少(圖4B和圖4D)。定量分析表明，輻射組大鼠海馬組織神經(jīng)元尼氏體平均光密度(mean optical density, MOD)與對照組相比顯著降低(n=6,P<0.05)。

圖4 微波輻射后對照組和輻射組大鼠海馬尼氏體染色結(jié)果比較A：微波輻射后對照組大鼠海馬神經(jīng)元尼氏體圖像，示尼氏體含量豐富(Scale bar= 100 μm)；B：微波輻射后輻射組大鼠海馬神經(jīng)元尼氏體圖像，示尼氏體含量明顯減少(Scale bar= 100 μm)；C：微波輻射后對照組大鼠海馬神經(jīng)元尼氏體圖像，示尼氏體含量豐富(Scale bar= 50 μm)；D：微波輻射后輻射組大鼠海馬神經(jīng)元尼氏體圖像，示尼氏體含量明顯減少(Scale bar= 50 μm)。E：微波輻射后對照組和輻射組大鼠海馬神經(jīng)元尼氏體平均光密度(MOD)比較。*示P<0.05

3 討論

隨著電子技術(shù)的發(fā)展，電磁輻射逐漸成為繼空氣、水體、噪聲污染之后的第四大環(huán)境污染源[6]。腦是微波輻射的敏感靶器官，既往研究表明，微波輻射會對大鼠腦組織結(jié)構(gòu)造成損傷，從而引起相關(guān)認(rèn)知功能障礙。Karimi N等[7]發(fā)現(xiàn)2.45 GHz微波輻射會導(dǎo)致大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力受損。Ma D等[8]發(fā)現(xiàn)30 mW/cm2微波輻射可以導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)記憶損傷，以及海馬組織中氨基酸類、膽堿類神經(jīng)遞質(zhì)代謝紊亂。徐新萍等[9]發(fā)現(xiàn)10 mW/cm2微波連續(xù)輻射3 d后大鼠學(xué)習(xí)記憶功能受損，海馬區(qū)組織結(jié)構(gòu)異常。

然而，目前針對連續(xù)高強度微波輻射造成的識別記憶障礙及其組織結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的研究尚未見報道。許多神經(jīng)退行性疾病(如阿爾茨海默癥、精神分裂癥)均會對識別記憶能力造成影響[10-12]。新物體識別是評估嚙齒動物對新異物體偏好的方法?？梢詫游锏淖R別記憶進(jìn)行評估[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，在新物體識別檢測中，在50 mW/cm2微波輻射后，與對照組相比輻射組大鼠移動距離和平均速度均顯著下降(移動距離：P<0.05，平均速度：P<0.05)，表明大鼠的運動欲望和運動能力顯著減弱。同時，本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比輻射組大鼠辨別指數(shù)顯著下降(P<0.05)，表明大鼠的對新異物體的識別和探索欲望降低，提示50 mW/cm2連續(xù)高強度微波輻射后大鼠識別記憶出現(xiàn)障礙。

海馬區(qū)是識別記憶執(zhí)行所依賴的重要腦區(qū)，海馬結(jié)構(gòu)的損傷與識別記憶功能障礙密切相關(guān)[14]。為了闡明連續(xù)高強度微波輻射誘發(fā)大鼠識別記憶障礙的組織結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，我們對輻射后大鼠海馬神經(jīng)元組織結(jié)構(gòu)狀態(tài)分別進(jìn)行了定性和定量的檢測和分析。一方面，一定劑量微波輻射可導(dǎo)致大鼠海馬神經(jīng)元組織結(jié)構(gòu)損傷[15-17]。李文潮等[18]發(fā)現(xiàn)30 mW/cm2微波輻射可導(dǎo)致海馬組織DG去錐體細(xì)胞胞漿部分胞盒呈陽性。Zhao L等[16]發(fā)現(xiàn)30 mW/cm2微波輻射后大鼠海馬線粒體超微結(jié)構(gòu)變化，主要表現(xiàn)為海馬組織輕度水腫、線粒體嵴不規(guī)則、腫脹、空泡化。本研究發(fā)現(xiàn)，在連續(xù)高強度微波輻射后，輻射組大鼠與對照組大鼠相比， 海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)異常，主要表現(xiàn)為核固縮、深染。另一方面，既往研究表明，一定劑量微波輻射可導(dǎo)致大鼠海馬神經(jīng)元胞漿內(nèi)尼氏體的含量下降。Chen J等[5]發(fā)現(xiàn)連續(xù)高強度微波輻射均可導(dǎo)致大鼠海馬神經(jīng)元尼氏體減少。任俊輝等[19]發(fā)現(xiàn)30 mW/cm2微波輻射可以導(dǎo)致大鼠海馬和皮層神經(jīng)元尼氏體含量均顯著減少。尼氏體主要由粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和游離的核糖體組成，是神經(jīng)元的重要結(jié)構(gòu)特征，且與神經(jīng)元的狀態(tài)和功能密切相關(guān)。當(dāng)神經(jīng)元損傷時，尼氏體往往會溶解消失。因此，尼氏體染色可反映神經(jīng)元的損傷情況。在本研究中，50 mW/cm2微波輻射后大鼠海馬神經(jīng)元尼氏體含量減少。上述結(jié)果提示，連續(xù)高強度微波輻射造成的識別記憶障礙的組織結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)為海馬神經(jīng)元組織結(jié)構(gòu)損傷。

綜上，連續(xù)高強度微波輻射可造成大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元組織結(jié)構(gòu)損傷，從而引發(fā)大鼠識別記憶障礙。本研究首次探索了連續(xù)高劑量、連續(xù)高強度微波輻射對大鼠識別記憶的影響，為其損傷診斷和防治方法的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。