王志，潘啟華,2，陸可，羅君志，夏必琳，姜正正，申萍，劉紅，陳天圣,2

1.華中農業(yè)大學水產學院/農業(yè)農村部淡水生物繁育重點實驗室，武漢 430070；2.集美大學水產學院/農業(yè)農村部東海海水健康養(yǎng)殖重點實驗室，廈門 361021

宿主的原癌基因jun(Jun proto-oncogene,AP-1 transcription factor subunit)是一類表達廣泛、多功能的轉錄調節(jié)因子，不僅和癌癥、血管生成息息相關，也參與了機體的免疫調節(jié)和病毒的感染過程[1-2]。Jun屬于轉錄因子激活劑蛋白Ⅰ(activated protein 1,AP-1)的亞族[1]，包含3個重要的蛋白結構域：Delta結構域、反式激活結構域和DNA結合與二聚化結構域[2]。研究發(fā)現(xiàn)JUN能被JNK(c-Jun N-terminal kinase)磷酸化激活，并與JUND(JunD proto-oncogene,AP-1 transcription factor subunit)在腎上腺髓質素反應中二聚化形成AP-1參與到腫瘤的進程中[3]。

研究表明Jun參與病毒相關的免疫調節(jié)通路[4-6]。例如，在牛痘病毒(vaccinia virus,VACV)侵染鼠胚胎纖維母細胞的實驗中，病毒激活Jun的表達，從而促進病毒早期復制，加速病毒的擴散[7]。凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)jun對具有先天性免疫功能的血藍蛋白的轉錄調節(jié)至關重要[8]；此外，Jun能結合到凡納濱對蝦基質金屬蛋白酶mmp-2(matrix metalloproteinase-2)啟動子上，激活mmp-2的表達，而mmp-2又與許多的抗菌肽活性相關[9]。在紅唇胭脂魚(Lizahaematocheila)中，jun和fos都能調節(jié)ap-1的啟動子進而對免疫反應發(fā)揮重要作用[10]。在斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)的GS細胞實驗中，過表達突變型jun后，病毒的轉錄水平降低的同時細胞病變效應出現(xiàn)延遲[11]。在禽類成纖維母細胞中，宿主和病毒編碼的高致癌性蛋白JUN(V-JUN)因具備分子的同源性，成為病毒復制過程中的重要媒介[12]。以上文獻表明，jun是宿主抗病毒信號通路中潛在的負反饋因子，可能是魚類分子抗病育種中的一個候選因子，需要進一步進行驗證。

日本青鳉(Oryziaslatipes)是一種生殖周期短、便于實驗室養(yǎng)殖、具有公開的基因組、容易開展基因編輯育種的模式魚類，對其基因的功能分析有助于養(yǎng)殖魚類的基因功能驗證[13]。為了進一步了解jun基因在魚類抗病毒天然免疫方面的功能，本研究以日本青鳉為研究對象，采用CRISPR/Cas9介導的基因編輯技術獲得jun缺失的純合子突變體品系，并對其在神經壞死病毒(nervous necrosis virus，NNV)感染過程中的特征展開研究，以期為養(yǎng)殖魚類的抗病育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

日本青鳉為華中農業(yè)大學水產學院模式魚類繁育實驗室飼養(yǎng)的HdrR品系，養(yǎng)殖在水溫28 ℃、光照周期明∶暗為14 h∶10 h的循環(huán)水系統(tǒng)中[14]。性成熟的青鳉通過自然繁殖的方式獲得后代，胚胎放置于培養(yǎng)液中，在28 ℃培養(yǎng)箱孵育[13]。實驗動物處理按照華中農業(yè)大學科學倫理委員會批準的規(guī)程進行。

1.2 jun編碼序列的鑒定

在NCBI上下載預測的青鳉juncDNA序列(gene ID:LOC101173011)，設計擴增編碼區(qū)(coding sequence,CDS)的引物(表1)。選擇表達量高的性腺，采用RNAiso Plus試劑盒提取總RNA，使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser反轉錄試劑盒(TaKaRa，日本)經過反轉錄獲得cDNA。采用Q5高保真的DNA聚合酶(BioLabs，美國)進行PCR擴增獲得jun的CDS序列，反應條件為94 ℃ 3 min；35 個循環(huán)：94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s；最后72 ℃延伸10 min。隨后將擴增的PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，確定大小正確后，回收目的片段連接到pMD18-T(TaKaRa，日本)載體，連接產物轉化到DH5α感受態(tài)細胞中，送陽性克隆至武漢擎科生物有限公司測序。

1.3 Jun系統(tǒng)進化樹的構建

在NCBI網站下載人、鼠、豬、斑馬魚和青鳉的Jun和同家族Junb、Jund的序列，通過MEGA7中的ClustalW方法進行蛋白的多序列比對，使用Neighbor-joining方法構建系統(tǒng)進化樹，Bootstrap method參數(shù)設置為1 000。

1.4 jun的表達模式分析

提取野生型青鳉成魚的眼、腦、鰓、心臟、頭腎、卵巢、精巢、肝臟、脾臟9個組織的總RNA，反轉錄獲得各個組織的cDNA。設計引物junRT-F/RT-R(表1)，通過半定量PCR檢測基因在各個組織表達，以β-actin基因作為內參。PCR反應條件為：95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃，25個循環(huán)，延伸10 s，25個循環(huán)。PCR產物在2%瓊脂糖凝膠上分離。

1.5 jun突變體的構建

根據(jù)NCBI上的日本青鳉jun基因序列，在網站https://cctop.cos.uni-heidelberg.de:8043/上設計合適的敲除靶位點，選擇分值高且脫靶風險小的靶點junsg1/sg2F(表 1)。在靶序列5′端前加T7啟動子序列，在3′端加sgRNA scaffold引物擴增序列，具體的sgRNA(single guide RNA)的上游引物為：5′TGTAATACGACTCACTATAGG-(gRNA 20 nt)-GTTTTAGAGCTAGAAAT 3′，下游引物為來自模板pMD19T-sgRNA的通用引物gRNA-R(表 1)[14]，引物由武漢擎科生物技術有限公司合成。以pMD19T-sgRNA為模板用PCR擴增出雙鏈的sgRNA，反應條件如下：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，34個循環(huán)，然后使用T7轉錄試劑盒(mMESSAGE mMACHINETMT7 transcription kit,Thermofisher)轉錄出sgRNA，并使用氯化鋰沉淀法純化回收sgRNA。Cas9 mRNA按照文獻純化制備，將Cas9(300 ng/μL)和sgRNA(50 ng/μL)的混合液注射到1細胞期的青鳉胚胎[15]。在胚胎發(fā)育4 d后提取注射的部分胚胎DNA，使用檢測引物junDF/DR(表1)PCR擴增jun的靶位點片段，突變型的PCR產物與野生型的相比明顯變短。將注射的F0胚胎養(yǎng)至成魚。然后通過尾鰭檢測PCR產物來篩選F0突變成魚，將突變體F0代成魚與野生型雜交，獲得F1代突變體。將F1代養(yǎng)至成魚，再通過單克隆測序篩選出F1代中突變一致的類型進行自交得到的F2代并養(yǎng)至成魚，通過PCR篩選出F2代中的純合子突變體，并將突變的純合子繁殖擴大以供后續(xù)實驗使用。

表1 實驗所用引物 Table 1 Primers used in the experiment

1.6 突變體jun—/—Δ124仔魚和成魚NNV攻毒實驗和病毒定量分析

收取野生型青鳉胚胎，待仔魚孵化出膜3 d后，每組15尾放入35 mm培養(yǎng)皿中加入總體積為4 mL的胚胎培養(yǎng)液。設置0、2、10、50、100、200 μL神經壞死病毒進行病毒濃度梯度的預實驗，以確定半致死病毒劑量。實驗中的NNV是筆者所在實驗室從患病石斑魚分離獲得的，采用RGNNV的保守引物經過PCR擴增全長后測序，序列確定為RGNNV，其包含2條RNA鏈，分別為RNA1(2.9 kb，NCBI序列號MZ053461)和RNA2(1.4 kb，NCBI序列號 MN105076.1)，將病毒在石斑魚GE細胞中擴增后保存于-80 ℃(未發(fā)表)。

參考預實驗數(shù)據(jù)對仔魚進行病毒感染實驗。試驗設置空白對照組(野生青鳉仔魚不加NNV)、對照組(野生青鳉仔魚加NNV)和實驗組(jun-/-Δ124突變體仔魚加NNV)。對照組和實驗組均加入100 μL NNV，每隔12 h觀察記錄每組的死亡數(shù)，實驗共重復7次，最后繪制對照組和處理組的死亡曲線。

對成魚進行病毒感染實驗時，使用微量注射器從野生型(對照組)和突變體成魚(實驗組)的泄殖孔向腹腔內注射25 μL NNV，每組注射10尾，感染2周后取樣。由于NNV主要攻擊神經組織密集的腦和眼組織，提取腦、眼、鰓和肌肉4個組織RNA，通過qRT-PCR檢測jun-/-Δ124和野生型各組織中NNV病毒的相對復制量(表 1)。

1.7 jun—/—Δ124相對于野生型在不同條件下干擾素相關基因的表達

設計與干擾素通路相關的4個基因jun、fosl1(FOS-like antigen 1)、tbk1(TANK-binding kinase 1)、irf3(interferon regulatory factor 3)的qRT-PCR引物(表1)，檢測在NNV病毒誘導下，jun-/-Δ124和野生型的個體中各基因的表達。實驗對象為孵化出膜3 d的仔魚，共設置4組。即野生對照組(野生青鳉仔魚不加NNV誘導)、野生實驗組(野生青鳉仔魚加NNV誘導)、突變體對照組(突變體青鳉仔魚不加NNV誘導)和突變體實驗組(突變體青鳉仔魚加NNV誘導)。每組10尾魚，NNV誘導劑量為100 μL。病毒誘導4 d后取樣，用qRT-PCR檢測4組樣品中各基因的表達。

每組各取3尾魚進行檢測，同時設置陰性空白對照。使用β-actin作為內參基因，基因的相對表達量采用2-△△Ct法進行計算。

1.8 統(tǒng)計學分析

試驗數(shù)據(jù)均用“平均值±標準差”表示，并用GraphPad Prism 5軟件t-tests中的Two-tailed對實驗結果進行統(tǒng)計學分析，顯著性差異設為*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1。

2 結果與分析

2.1 青鳉jun基因的CDS序列

采用高保真DNA聚合酶，使用表1中的引物，PCR擴增后得到目的條帶約為1 000 bp的junCDS片段，克隆到T載體后，對目的條帶進行測序。測序獲得的青鳉jun的CDS由起始密碼(ATG)到終止子(TAG)全長為921 bp，共編碼306個氨基酸(amino acid,aa)，包括N端(5～209 aa)的Jun超家族結構域和C端(230～290 aa)的bZIP超家族結構域(圖1)。

jun CDS序列和對應的蛋白序列，擴增引物用下劃線標注，紅色堿基為gRNA序列，灰色為Jun超家族結構域；黃色為bZIP結構域。The jun CDS sequence and the deduced protein sequences:underline:amplified primers; red bases:gRNA sequences; gray：Jun-like transcription factor domain; yellow:bZIP domain.

2.2 Jun的系統(tǒng)進化關系

通過系統(tǒng)進化分析可以看出，Jun、Junb和Jund在各支內都表現(xiàn)為硬骨魚綱的青鳉和斑馬魚親緣關系更近，而哺乳綱的人、鼠、豬親緣關系更近(圖2)。

圖2 3個Jun家族的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree analysis of three Jun families

2.3 jun表達模式

以β-actin為內參，對眼、腦、鰓、心臟、頭腎、卵巢、精巢、肝臟、脾臟9個組織內jun的基因表達進行半定量PCR檢測，發(fā)現(xiàn)其在所檢測的9個組織中都表現(xiàn)出較高的表達水平，檢測結果如圖3所示。

圖3 青鳉組織中jun的表達模式Fig.3 Expression pattern of jun in various medaka tissues

2.4 jun突變體品系構建

通過顯微注射將合成好的靶點sgRNA1(5′ ATCCTGACGTCGCCCGATGT3′)/sgRNA2(5′ GGACAGACAGTTGCTACCGG3′)和Cas9 mRNA共注射到早期胚胎，經過F0代突變體親本篩選、F1代同種突變類型雜合子單克隆篩選和F2代純合子突變體篩選，獲得了jun缺失124個堿基的純合子的突變體品系(MT：jun-/-Δ124)。對該突變體品系的DNA和蛋白結構進行預測(圖4)，發(fā)現(xiàn)突變體蛋白缺失了Jun家族結構域和bZIP結構域，在第59個氨基酸處出現(xiàn)翻譯終止，為有效的突變類型。

2.5 jun—/—Δ124仔魚和成魚的NNV病毒攻毒結果

根據(jù)最終獲得的死亡曲線(圖5A)可以看出jun-/-Δ124突變體品系相對于野生型具有明顯的抗病毒效果。仔魚死亡的判別依據(jù)：軀體明顯腐壞呈骨架狀或腫大，仔魚眼睛明顯腫大且眼間距增大，仔魚的尾部明顯彎曲，鰾點消失(圖5B)。另外，在成魚的病毒感染實驗中，在突變體的眼(圖5C)、腦(圖5D)、鰓(圖5E)和肌肉(圖5F)中NNV的RNA2基因的表達明顯低于野生對照組。這說明jun-/-Δ124突變體的NNV病毒量較少，因此突變體相較于野生型對NNV更為耐受。

A.青鳉jun；B.突變體jun-/-Δ124的篩選過程，紅色為純合子突變體；C.突變體的序列對比，紅色為缺失124 bp突變體；D.青鳉野生型和突變型jun-/- Δ124的蛋白結構域。A.The medaka jun gene; B.PCR screening result of mutant jun-/-Δ124，-124 bp mutant were labeled by red color; C.Sequence comparison of WT and mutants,jun-/-Δ124 as indicated by red arrow; D.The protein domain of wild-type (WT) and jun-/-Δ124 (MT).

A.攻毒期間仔魚的存活率；B.從NNV處理開始經歷8.5 d三組仔魚的存活情況，死亡的仔魚用紅色箭頭標出；C-F.NNV病毒RNA2基因在眼、腦、鰓和肌肉中的表達。誤差線表示平均值±標準偏差，****P<0.000 1。A.Survival rate of larvae during challenge; B.After 8.5 d from NNV treatment,the survival of larvae in the three groups,dead larvae were marked with red arrows; C-F.Expression of RNA2 gene of NNV virus in eye,brain,gill and muscle.The error line represents the mean ± standard deviation,****P<0.0001.

2.6 jun—/—Δ124干擾素相關基因的表達

通過qRT-PCR檢測干擾素相關基因jun、fosl1、tbk1、irf3在NNV誘導下的野生型和突變體內的表達情況，發(fā)現(xiàn)在病毒誘導后，野生型內的相關基因表達都有不同程度的上調，說明這些基因參與了抗病毒免疫反應。jun在jun-/-Δ124突變體中的表達極顯著降低(P<0.000 1)(圖6A)，說明jun的表達在突變體內受阻；在無病毒誘導情況下，jun-/-Δ124突變體中fosl1的表達相對于野生型有極顯著增高(P<0.001)，但在病毒誘導下相對于野生型的表達極顯著降低(P<0.000 1)，而在jun-/-Δ124突變體中fosl1的表達在病毒誘導或不誘導下均沒有顯著差異(圖6B)；在無病毒誘導下，tbk1在jun-/-Δ124突變體中的表達相對于野生型沒有顯著差異，但在病毒誘導下相對于野生型也有降低(P<0.05)，同時在jun-/-Δ124突變體中tbk1的表達在有無病毒誘導下兩者也沒有顯著差異(圖6C)；irf3在不誘導的條件下，在jun-/-Δ124突變體中相對野生型沒有顯著差異，但是在病毒誘導的突變體內irf3的表達水平有極顯著的上調(P<0.000 1)，同時在突變體jun-/-Δ124中病毒誘導之后的表達量極顯著升高(P<0.000 1)(圖6D)。

A-D.NNV誘導下jun、fols1、tbk1、irf3在jun-/-Δ124和野生型中的相對表達。誤差線表示平均值±標準偏差，* P<0.05，***P<0.001，****P<0.0001。A-D.Relative expression of jun、fosl1、tbk1、irf3 in jun-/-Δ124 and WT induced by NNV.Error bars represent mean±SD.* P<0.05,***P<0.001,****P<0.0001.

3 討 論

宿主的jun是機體參與病毒感染和免疫調節(jié)的一個重要因子。本研究克隆了青鳉的jun基因，并通過基因編輯技術構建了突變體，初步研究發(fā)現(xiàn)其具有明顯的抗病毒效果，而且突變體成魚體內的病毒相對含量要比對照組顯著降低，因此認為青鳉的jun是病毒感染過程中的負反饋因子。

轉錄因子AP-1由許多的同源或異源的二聚體結合形成，包含bZIP(basic region leucine zipper,bZIP)轉錄因子家族結構域的成員，比如Jun、Fos、Atf[16]。研究發(fā)現(xiàn)，很多致癌性的病毒通過編碼病毒bZIP轉錄因子來影響宿主細胞的免疫反應，使得病毒的復制更為有利[17]。在本研究中鑒定的青鳉jun基因，其蛋白結構含有經典的Jun超家族結構域和bZIP結構域，其蛋白序列進化關系和泛表達模式也符合jun基因的特性。在突變體青鳉中，在59 aa處Jun蛋白翻譯終止，導致其完全缺失bZIP蛋白結構域，這可能是突變體具有抗病毒效果的重要原因。

干擾素相關基因fosl1、tbk1、irf3也都與病毒的感染有關。三磷酸腺苷依賴解旋酶DDX3(DEAD-box RNA helicase)是一種熟知的能夠抑制乙肝病毒的宿主因子，它能夠通過TBK1/IKKε(Inhibitor of kappa B kinase ε)/IRF[18]和干擾素β啟動子刺激因子增強機體的先天性免疫。人參皂苷能夠通過Akt(又稱PKB，Protein kinase B)/p53(Interleukin-12A)通路刺激DDX3的啟動子活性進而激活TBK1/IKKε/IRF信號并增強先天性免疫應答[19]。研究還發(fā)現(xiàn)人參皂苷能夠通過抑制JNK/AP-1通路進而阻滯乙肝病毒的復制[20]。此外，研究表明JNK能夠磷酸化激活Jun，進而促進AP-1的合成[3]。因此，TBK1和c-Jun/AP-1在功能上可能存在拮抗關系，當jun敲除之后，機體內的jun表現(xiàn)為低水平的狀態(tài)，所以在jun突變體中的tbk1的表達水平也處在一個相對低的水平。fosl1能夠通過阻滯TBK1和TRAF3/TRIF(TIR-domain-containing adaptor-inducing interferon β)的互作抑制Ⅰ型干擾素的表達[21]。本研究通過qRT-PCR結果分析發(fā)現(xiàn)，fosl1本身能被病毒誘導而表達增高，但在突變體中，在缺少了jun的抑制作用后，干擾素表現(xiàn)為高水平狀態(tài)。而tbk1在突變體或者NNV病毒誘導下表達都顯著降低，因此，fosl1也處于較低水平，但fosl1并不能直接抑制干擾素的表達。且在突變體內有無病毒的誘導，fosl1和tbk1的表達都沒有顯著變化，說明fosl1和tbk1的表達可能與jun無直接的聯(lián)系。此外，irf3是調節(jié)I型干擾素合成的轉錄因子，能誘導IFNβ的表達，是機體病毒免疫應答的關鍵調控因子[22]。在免疫細胞中普遍表達的賴氨酸乙酰轉移酶Kat8能夠乙酰化irf3進而降低irf3的轉錄活性，導致ifn-Ⅰ的表達降低。同時，Kat8敲除的小鼠對病毒的耐受力獲得增強[23]。在鯽(CarassiusauratusL.)中，irf3的過表達會激活Ifn的產生，而過表達突變irf3則因為抑制了IFN的產生，破壞了poly-IC激活干擾素刺激基因的反應[24]。以上多個研究都表明，irf3能夠直接參與干擾素的產生，缺失irf3的突變體中的病毒耐受能力明顯變差。在本研究中，敲除jun基因后，受到病毒感染后機體irf3的表達相對于野生型極顯著上調，同時在突變體內irf3的表達量在病毒誘導的條件下相對于無病毒誘導組也極顯著地上調。這說明jun的缺失可能直接導致了irf3的上調，Jun可以通過抑制Irf3/Ifn通路抑制干擾素的表達。因此，突變體病毒耐受能力的提高可能是通過Irf3調控的信號通路增強了干擾素表達的結果。

綜上所述，本研究推斷青鳉jun基因可能是宿主在抗病毒感染過程中的負調控因子，可作為抗病毒育種改良的候選基因。