徐 佳，魏 莉，蔡國(guó)青，郭 倩，王運(yùn)萍，楊 紅

(空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安 710032)

卵巢癌是婦科惡性程度較高的腫瘤，其發(fā)病率位于婦科腫瘤第二位[1]。由于卵巢癌早期病變不易發(fā)現(xiàn)，晚期病例缺乏有效的治療手段，其致死率在婦科腫瘤中居于首位，對(duì)女性的生命健康造成嚴(yán)重威脅。目前卵巢癌的治療包括手術(shù)切除，輔助以化療、放療以及靶向治療等綜合方案[2-3]。大多數(shù)晚期卵巢癌患者對(duì)基于鉑類的化療方案產(chǎn)生耐藥，并導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。因此，尋找安全有效治療卵巢癌的藥物對(duì)于提高患者療效具有重要的意義。薏苡仁油是從薏苡仁的種核中提取的天然成分，含有多種活性物質(zhì)，如脂類、多糖類、木脂素類、酚類和腺苷等。薏苡仁在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)具有利水除濕等作用，而經(jīng)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)其具有抗感染、提高免疫力、鎮(zhèn)痛以及抗腫瘤等多種藥理作用，目前多在胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌等領(lǐng)域研究[4]。然而，薏苡仁油對(duì)卵巢癌的研究較少且機(jī)制尚不清楚。本研究通過以卵巢癌SKOV3細(xì)胞為模型，探討薏苡仁油對(duì)其可能的影響及作用機(jī)制，為薏苡仁油的臨床應(yīng)用提出理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試劑和儀器

噻唑蘭(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)試劑(USA，Amresco公司 )；IP組織細(xì)胞裂解液(上海碧云天)；Rabbit Anti-Bax、Bcl-2、Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9、P53(USA，cell signaling)；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔、抗大鼠的第二抗體(USA.Santa Cruz)；聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)(USA.Millipore)；半干轉(zhuǎn)膜儀(USA.Bio-Red)；MD-100全自動(dòng)生化儀(USA.MD)。卵巢癌細(xì)胞SKOV3源自空軍軍醫(yī)大學(xué)婦產(chǎn)科實(shí)驗(yàn)室，薏苡仁油空軍軍醫(yī)大學(xué)藥劑科實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物的配制

將薏苡仁油化學(xué)成分提取物溶解于二甲基亞砜中，根據(jù)前期試驗(yàn)，配制終濃度為5μg/mL，經(jīng)0.45nm濾膜過濾除菌備用。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)

將人卵巢癌SKOV3細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇，接種于含10%新生牛血清，10×104U/L青霉素和100mg/L鏈霉素得RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37℃，體積分?jǐn)?shù)5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。所有細(xì)胞株從液氮中取出后進(jìn)行復(fù)蘇，置入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶中約80%時(shí)進(jìn)行傳代，所有細(xì)胞常規(guī)傳代2次，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好無污染的細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 MTT法檢測(cè)薏苡仁油對(duì)SKOV3細(xì)胞活性的影響

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SKOV3細(xì)胞，胰酶消化后，離心，重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×103個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液，接種于96孔板過夜。對(duì)照組加入完全培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組分別加入含有不同濃度薏苡仁油的培養(yǎng)基，終濃度分別為50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、500μg/mL，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48、72h后，加入20μL的5mg/mL的MTT繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150μL的DMSO，酶標(biāo)儀490nm檢測(cè)各孔的吸光度(A)值。

1.5 Hoechst33342/PI、AO/EB熒光染色

取細(xì)胞濃度為5×103個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液，接種于24孔板中，待細(xì)胞貼壁匯集80%時(shí)，分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組采用3個(gè)不同濃度薏苡仁油進(jìn)行處理(50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL)。繼續(xù)培養(yǎng)48h，細(xì)胞進(jìn)行Hoechst33342/PI、AO/EB熒光染色。①Hoechst33342/PI染色：向細(xì)胞中加入用0.01mol磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution，PBS)的Hoechst 33342，終濃度為10μg/mL，37℃反應(yīng)10min；繼續(xù)加入用0.01mol PBS溶解的PI，使它的終濃度為10μg/mL，4℃反應(yīng)20min；直接加入4%多聚甲醛固定液，與培養(yǎng)液按1∶3混合，固定細(xì)胞10min；棄上清，50%甘油封片，熒光顯微鏡下檢測(cè)并獲取照片。②AO/EB熒光染色：向細(xì)胞中加入用0.01mol PBS溶解的AO、EB，終濃度為50μg/mL，37℃染色10min；PBS洗脫2次，每次3min。50%甘油封片，熒光顯微鏡下檢測(cè)并獲取照片。

1.6 DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

取對(duì)生長(zhǎng)的細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶后收集細(xì)胞，1 000r/min離心10min，取沉淀加核裂解液(0.121g Tris，Nacl 0.8766g，EDTA 0.372，SDS 4g，溶至100mL去離子水中，臨用前加入蛋白酶K 100μg/mL)1mL，37℃裂解過夜，次日從水浴中取出，加1mL飽和酚抽提，6 000r/min離心5min，取上清液加1mL氯仿：異戊醇(24∶1)抽提，6 000r/min離心5min，取上清加50μL 3mmol/L乙酸鈉和2mL冷凍無水乙醇，置液氮中冰凍10min，取出12 000r/min離心10min，棄除上清，沉淀室溫放置30min晾干，加50μL TE緩沖液、5μl RNase，37℃水浴30min，加適量上樣緩沖液行1.5%瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA降解條帶。

1.7流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡

細(xì)胞接種于6孔板中，按1.5項(xiàng)下分組實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束，棄上清，用0.25% Trg消化，分別收集各組細(xì)胞于EP管中，以0.1mmol/L PBS(pH7.4)液洗滌1次，離心1 000r/min，5min，棄上清液。用190μL結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，加入5μL Annexin-V-FATC，混勻，避光室溫作用10min。再加10μL PI，混勻，避光室溫作用10min。補(bǔ)充結(jié)合液300μL，1h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.8細(xì)胞總蛋白的提取與測(cè)定

蛋白提?。悍謩e取1.7項(xiàng)下各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液洗滌兩次，吸干后多余水分，加IP組織細(xì)胞裂解液，按試劑盒說明書項(xiàng)下制備，混勻，4℃靜置30min；然后離心15min，取上清與BCA試劑混合，37℃ 30min，置酶標(biāo)儀570nm波長(zhǎng)處測(cè)定組織、細(xì)胞吸光度值(A值)，按公式計(jì)算出總蛋白含量。

1.9蛋白質(zhì)印跡法分析細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

取30mg細(xì)胞總蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以10%脫脂奶粉封閉后，分別與Caspase 3 (cell signaling，USA，1∶1 000)、Caspase 8(cell signaling，USA，1∶1 000)、Caspase9(cell signaling，USA，1∶1 000)、Bax(cell signaling，USA，1∶1 000)、Bcl-2(cell signaling，USA，1∶1 000)、GAPDH(cell signaling,USA;1∶1 000)，4℃孵育過夜，洗滌后再加第二抗體山羊抗兔HRP標(biāo)記IgG(Santa Cruz，Biotechnology，USA，1∶3 000)，37℃雜交70min，化學(xué)發(fā)光、顯影、壓片。膠片結(jié)果采用Gel-pro Analyzer(Bio-Rad)成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像和數(shù)據(jù)處理，每項(xiàng)檢測(cè)均采用不同樣本重復(fù)3次。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同濃度薏苡仁油對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞的影響

MTT試驗(yàn)顯示不同濃度薏苡仁油(50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、500μg/mL)分別作用于SKOV3細(xì)胞，與對(duì)照組比較，薏苡仁油50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL作用于SKOV3細(xì)胞24h、48h、72h存活率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值0.563～1.027，P>0.05)。與對(duì)照組相比，400μg/mL和500μg/mL薏苡仁油濃度可在處理后24h、48h和72h顯著降低SKOV3細(xì)胞存活率(t值4.635～5.231，P<0.05)，其作用隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，提示高濃度薏苡仁油對(duì)SKOV3細(xì)胞具有殺傷作用。因此，觀察薏苡仁油對(duì)SKOV3細(xì)胞的凋亡較好濃度選擇應(yīng)為50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL，作用時(shí)間在48h較好，見表1。

表1 薏苡仁油對(duì)不同時(shí)間段卵巢癌細(xì)胞株SKOV3存活率的影響Table 1 Effect of Coix seed oil on the survival rate of SKOV3 ovarian cancer cells in different

2.2 不同濃度薏苡仁油對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞形態(tài)的影響

Hoechst33342/PI染色后，通過熒光顯微鏡可以觀察，對(duì)照組細(xì)胞呈均勻的藍(lán)色熒光，經(jīng)薏苡仁油50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL作用48h后，隨著濃度的增加，凋亡細(xì)胞增多，細(xì)胞膜與細(xì)胞核呈濃縮、致密的強(qiáng)藍(lán)色熒光，出現(xiàn)凋亡小體，表明薏苡仁油可誘導(dǎo)卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡，見圖1。AO/EB染色后，通過熒光顯微鏡可以觀察，對(duì)照組細(xì)胞呈均勻的綠色熒光，經(jīng)薏苡仁油50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL作用48h后，隨著濃度的增加，凋亡細(xì)胞增多，細(xì)胞膜與細(xì)胞核呈濃縮、致密的亮黃色熒光，出現(xiàn)凋亡小體，表明薏苡仁油可誘導(dǎo)卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡，見圖2。

圖1 Hoechst33342/PI染色薏苡仁油促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞株SKOV3的凋亡Fig.1 Hoechst33342/PI staining of Coix seed oil promoted apoptosis in SKOV3 ovarian cancer cells

圖2 AO/EB染色薏苡仁油促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞株SKOV3的凋亡Fig.2 AO/EB staining of Coix seed oil promoted apoptosis in SKOV3 ovarian cancer cells

2.3 DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)卵巢癌SKOV3凋亡的影響

薏苡仁油50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL作用于SKOV3細(xì)胞48h后，經(jīng)DNA瓊脂糖凝膠電泳后，凋亡細(xì)胞的DNA降解形成具有凋亡特征的梯形條帶，該條帶隨著薏苡仁油濃度的增高而增多，而對(duì)照組無梯形條帶。

2.4 不同濃度薏苡仁油對(duì)卵巢癌SKOV3凋亡的影響

不同濃度50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL組薏苡仁油作用于SKOV3細(xì)胞48h后，與對(duì)照組相比較，細(xì)胞凋亡均顯著增多(t值分別為2.536、3.012、4.908，均P<0.05)，其中200μg/mL組細(xì)胞總凋亡率高達(dá)(27.10±5.42)%，見圖4和表2。

圖3 SKOV3細(xì)胞凋亡DNA凝膠電泳圖Fig.3 DNA gel electrophoresis of apoptosis in SKOV3 ovarian cancer cells

A：流式細(xì)胞圖顯示結(jié)果；B：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)定量結(jié)果。與對(duì)照組比較，*P<0.05。圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度薏苡仁油對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡的影響A: flow cytometry results; B: quantitative results detected by flow cytometry.Comparison with control group,*P<0.05Fig.4 Effects of Coix seed oil at different concentrations on apoptosis in SKOV3 cells detected by flow cytometry

表2 不同濃度薏苡仁油對(duì)卵巢癌細(xì)胞株SKOV3凋亡的影響Table 2 Effects of Coix seed oil at different concentrations on apoptosis in SKOV3 ovarian cancer

2.5 薏苡仁油對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡基因表達(dá)的影響

不同濃度50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL組薏苡仁油作用于SKOV3細(xì)胞48h后，與對(duì)照組相比較，各濃度組Bax、Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9蛋白表達(dá)均顯著增高(t值2.436～5.709，P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下降(t值2.357～4.304，P<0.05)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖5。

A和D：Western blotting檢測(cè)結(jié)果；B：Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量；C：Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量；E：Caspase 3蛋白相對(duì)表達(dá)量；F：Caspase 8蛋白相對(duì)表達(dá)量；G：Caspase 9蛋白相對(duì)表達(dá)量。與對(duì)照組比較，*P<0.05圖5 不同濃度薏苡仁油對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡基因表達(dá)的影響A and D:Western blotting detection results;B:relative expression level of Bax protein;C:relative expression level of Bcl-2 protein; E:relative expression level of Caspase 3 protein; F:relative expression level of Caspase 8 protein; G:relative expression of Caspase 9 protein.Comparison with the control group,*P<0.05Fig.5 Effects of Coix seed oil at different concentrations on expression of apoptosis gene in SKOV3 cells

3討論

3.1 薏苡仁油對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響

卵巢癌早期病變不易發(fā)現(xiàn)，晚期缺乏有效的治療手段，其致死率居?jì)D科惡性腫瘤首位。對(duì)于大多數(shù)晚期卵巢癌患者，化療是卵巢癌術(shù)后輔助治療的重要手段，但是化療耐藥性的產(chǎn)生是導(dǎo)致卵巢癌治療失敗的重要原因，故尋找有效的抗癌藥物，對(duì)提高卵巢癌患者的生存率具有重要意義[5]。薏苡仁油具有廣譜的藥理活性，如抗腫瘤、抗炎、慢性潰瘍、免疫調(diào)節(jié)、肺水腫等，是具有廣闊前景的抗腫瘤藥物，目前對(duì)薏苡仁油的研究集中在其對(duì)于消化系統(tǒng)腫瘤、泌尿系統(tǒng)腫瘤抑制細(xì)胞增殖和凋亡的方面。本研究以卵巢癌SKOV3細(xì)胞作為研究模型，探討薏苡仁油對(duì)SKOV3細(xì)胞的作用及其機(jī)制。MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著薏苡仁油作用時(shí)間的延長(zhǎng)能夠顯著降低SKOV3細(xì)胞存活率，其機(jī)制可能與促進(jìn)卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡或抑制卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、轉(zhuǎn)移有關(guān)。

3.2 薏苡仁油對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡的作用

細(xì)胞凋亡是通過激活細(xì)胞內(nèi)在的“自殺”機(jī)制，導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡的方式之一，涉及到多基因表達(dá)、激活并受嚴(yán)格調(diào)控，細(xì)胞凋亡受到抑制會(huì)引發(fā)腫瘤的形成、轉(zhuǎn)移及其耐藥性的產(chǎn)生等。在此基礎(chǔ)上，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)薏苡仁油可通過不同信號(hào)通路抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，如在肝癌、食管癌、結(jié)腸癌等腫瘤中均有明顯的抗癌作用[6]。因此，為了進(jìn)一步觀察薏苡仁油體外誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞凋亡，本研究通過Hoechst33342/PI染色和AO/EB染色，發(fā)現(xiàn)經(jīng)不同濃度的薏苡仁油作用后，SKOV3細(xì)胞中凋亡細(xì)胞增多。進(jìn)一步通過DNA Ladder檢測(cè)，可見具有凋亡特征的梯形條帶。不同濃度50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL組薏苡仁油作用于SKOV3細(xì)胞48h后，與對(duì)照組相比較，細(xì)胞凋亡均顯著增多(P<0.05)，其中200μg/mL組細(xì)胞總凋亡率高達(dá)(27.10±5.42)%，以上結(jié)果均證實(shí)薏苡仁油具有誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞凋亡的作用，隨著薏苡仁油濃度的增加，細(xì)胞凋亡更為明顯。

3.3 薏苡仁油對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡的機(jī)制

細(xì)胞凋亡有多種途徑，Bcl-2家族和Caspase家族是細(xì)胞凋亡中的重要組成部分。Bcl-2家族是線粒體凋亡途徑的中心環(huán)節(jié)，包括促凋亡基因和抑制凋亡基因。其中當(dāng)Bax蛋白以同源二聚體存在時(shí)，易于誘發(fā)細(xì)胞凋亡，Bcl-2可以和Bax等分子形成異源二聚體，從而抑制細(xì)胞凋亡[7]。Caspase家族中目前認(rèn)為細(xì)胞凋亡的起始者分別是Caspase 2、8、9、10等，執(zhí)行者Caspase 多為Caspase 3、6、7等。其中關(guān)鍵分子分別為Caspase 8與Caspase 3[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比較，50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL組薏苡仁油濃度作用于SKOV3細(xì)胞48h后，各濃度組Bax、Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9蛋白表達(dá)均顯著增高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05)。通過進(jìn)一步western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著薏苡仁油的濃度升高，Caspase 3和Caspase 9蛋白表達(dá)量均逐漸增加，推測(cè)可能與Bcl-2升高在線粒體膜上形成通道蛋白，使線粒體跨膜電位下降，激活Caspase家族酶聯(lián)反應(yīng)，從而誘發(fā)SKOV3細(xì)胞凋亡有關(guān)。同時(shí)，薏苡仁油Caspase 3的活化進(jìn)一步促進(jìn)了Bcl-2/Bax的比值增高，誘發(fā)線粒體的凋亡途徑[9]。

綜上所述，薏苡仁油顯著抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡，可能與Bcl-2表達(dá)降低、Bax和Caspase蛋白表達(dá)升高有關(guān)。薏苡仁油通過促進(jìn)凋亡蛋白表達(dá)抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移，本研究結(jié)果將為卵巢癌治療提供新的方向。