張月婷，符 潮，劉新亮，戴小英，謝雄雄，汪信東

（江西省林業(yè)科學院·國家林業(yè)和草原樟樹工程技術研究中心，江西 南昌 330013）

基因編輯是依賴于通過基因工程改造的核酸酶在基因組特定位置上產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂(DSBs)，再利用非同源末端連接(NHEJ)或同源重組(HDR)來修復DSBs，修復過程易引起隨機插入、缺失，從而導致基因組的靶向突變[1]。

近年來，基因編輯技術快速發(fā)展，編輯工具也越來越多，其中規(guī)律性的成簇間隔短回文重復序列(CRISPR/Cas)[2-3]成為當前最熱門的基因編輯工具。CRISPR/Cas系統(tǒng)在生物醫(yī)療、基因功能研究、遺傳改良和分子育種等方面有著廣泛的發(fā)展前景和應用價值。本文回顧了CRISPR/Cas系統(tǒng)的發(fā)展和為提高編輯效率及編輯范圍的研究歷程，介紹了CRISPR/Cas系統(tǒng)在作物和林木改良中的應用，并展望了CRISPR/Cas系統(tǒng)的脫靶效應以及提高Cas蛋白的切割活性、多倍體植物和多基因功能研究的發(fā)展趨勢。

1 CRISPR/Cas系統(tǒng)

CRISPR/Cas系統(tǒng)是近年來出現(xiàn)的一種由sgRNA指導的，利用Cas核酸酶對靶位點進行定向編輯的系統(tǒng)。

1.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的發(fā)展歷程

20世紀中期，從事微生物信息學研究的科學家發(fā)現(xiàn)了一個顯著的序列特征，后來日本科學家將這一序列特征描述為一系列中間間隔著大腸桿菌基因組的重復短序列并將其稱為CRISPR[4]。在后面的研究中發(fā)現(xiàn)很多CRISPR中的間隔序列來源于質粒和病毒[5-6]。當外源質?；蚴删w入侵的時候，細菌會將它們的DNA整合到自身基因組中，這些插入的外源DNA最終被加工成成熟的crRNA。成熟的crRNA會引導Cas蛋白復合物對入侵者進行靶向切割，達到清除目的[2,7-8]。

2012年，有文獻報道化膿性鏈球菌CRISPR/Cas9蛋白是通過tracrRNA-crRNA雙鏈來靶向DNA斷裂的DNA內切核酸酶[9]。后來，科學家將crRNA和tracrRNA融合形成了單一性向導的RNA(sgRNA)。Cas9的HNH結構域可以切割成與sgRNA序列互補的DNA[10]，造成雙鏈斷裂(DSB)，當出現(xiàn)DSB時，其自身的保護機制會以非同源末端連接(NHEJ)和同源重組(HDR)兩種途徑進行修復。當機體以NHEJ途徑進行修復時，會造成堿基序列的刪除和插入；而以HDR途徑修復時，會實現(xiàn)對目的基因的精確編輯[7,11-12](圖1)。

圖1 CRISPR-Ca s 9工作原理示意圖[12]Fig.1 The Schematic diagram of CRISPR-Cas9 working model

1.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)和傳統(tǒng)基因編輯技術的比較

在過去的幾十年里，科學家們一直致力于開發(fā)更多基因編輯技術。目前主要有3種基因編輯技術：鋅指核酸酶技術(ZFN)、類轉錄激活因子效應物核酸酶技術(TALEN)[13-16]及CRISPR/Cas系統(tǒng)。前兩者結構比較類似：都由一個特異性識別并靶向目標DNA的識別域和一個DNA剪切域Fok I domain組成，它們基于蛋白識別機制來實現(xiàn)特異靶位點的識別，但這兩種技術的靶點選擇和載體構建都十分復雜，因此大大限制了它們的推廣與應用[17](表1)。與ZFNs和TALENs相比，CRISPR基因編輯技術以特異性強、適用性廣及操作簡單等特點，迅速成為主流的基因編輯技術。目前該技術已廣泛應用于小鼠、水稻、小麥、高梁、煙草和楊樹[18-19]等動植物中。

表1 常用基因編輯工具的比較Tab.1 Comparison of commonly used gene editing tools

2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的優(yōu)化

2.1 PAM位點的擴展

CRISPR/Cas9是當前最熱門的編輯工具，但是傳統(tǒng)的SpCas9識別的PAM位點是N;;或者NA;[20]，這大大縮小了該系統(tǒng)的應用范圍。2015年，Kleinstiver等[21]對野生型SpCas9的PAM相互作用域引入突變，成功得到了可以識別N;A;和N;C;的SpCas9變體，該變體拓寬了基因編輯的范圍。2018年，Hu等[22]使用噬菌體輔助連續(xù)進化的方法得到了SpCas9的變體xCas9，該變體可以識別N;、;AA和;AT。同一年，Hiroshi等[23]從結構生物學的角度出發(fā)設計了一種SpCas9的變體SpCas9-N;，該變體可以廣泛地識別N;序列，但SpCas9-N;在識別N;;位點時的切割活性低于野生型SpCas9。2020年，Walton等[24]設計了不需要特定PAM就能結合和切割DNA的Cas9變體，命名為Sp;和SpRY，能夠對絕大多數(shù)基因組進行不受限打靶。

2.2 單堿基編輯技術

CRISPR/Cas系統(tǒng)依賴于靶位點處的雙鏈斷裂而激活的DNA非同源末端連接(NHEJ)和同源重組(HDR)這兩種修復途徑。HDR精確性高于NHEJ，但是在細胞中HDR修復效率較低，為提高HDR的修復效率，2016年，Liu[25]發(fā)現(xiàn)了不需要DNA雙鏈斷裂就可進行單堿基轉換的基因編輯技術——單堿基編輯技術。單堿基編輯技術基于無雙鏈切割活性的Cas9(dCas9)或Cas9切口酶(nCas9)、胞嘧啶脫氨酶以及sgRNA形成的復合體在雙鏈DNA不斷裂的情況下，對靶位點進行精準編輯，實現(xiàn)一定范圍內的胞嘧啶(C)到胸腺嘧啶(T)或鳥嘌呤(;)到腺嘌呤(A)的單堿基轉換(圖2)。2017年11月，繼胞嘧啶堿基編輯技術后，Liu[26]接著報道了一種新型編輯器——腺嘌呤單堿基編輯器（ABEs）。該編輯器利用腺嘌呤脫氨酶(TadA)，實現(xiàn)一定范圍內的A·T到;·C堿基的轉變。目前，單堿基編輯技術已在植物中有了廣泛應用。

圖2 C-T的單堿基編輯[25]Fig.2 Single base editing for C-T

3 CRISPR/Cas系統(tǒng)在植物中的應用

近幾年，CRISPR/Cas系統(tǒng)在基因編輯領域掀起了革命性的風暴，由于該系統(tǒng)能夠同時對幾個靶基因進行編輯，使得該技術在異源多倍體植物的基因功能研究和遺傳改良等方面相比其它技術更有優(yōu)勢。下面將重點闡述CRISPR/Cas系統(tǒng)在作物和林木中的應用現(xiàn)狀。

3.1 作物中的應用

利用CRISPR/Cas系統(tǒng)進行作物改良的案例見表2。隨著CRISPR技術的發(fā)現(xiàn)及應用，Tang等[27]利用CRISPR/Cas9技術對水稻金屬轉運蛋白基因OsNramp5進行敲除，成功降低了秈稻稻粒中的鎘含量，開發(fā)了低鎘含量的新秈稻品種；中國水稻研究所邵高能等[28]采用CRISPR/Cas9技術對控制水稻香味的BADH2基因進行敲除，成功提高了水稻的香味；Wang[29]等利用CRISPR/Cas系統(tǒng)首次在六倍體小麥中對MLO基因的3個拷貝（TaMLO-A1、TaMLO-B1和TaMLO-D1）同時進行突變，獲得了對白粉病具有廣譜抗性的小麥材料；Liu等[30]利用CRISPR/Cas9技術設計同時靶向ERF轉錄因子OsERF922基因的多個sgRNA，分別獲得了在2個和3個位點處都具有突變的植株且它們抗稻瘟病的能力有不同程度的增強。

3.2 林木中的應用

林木具有周期長、基因組倍性復雜、雜合度高等生物學特點，長期以來林木遺傳改良進程較緩慢。CRISPR/Cas系統(tǒng)的出現(xiàn)對林木遺傳改良有很大的促進作用，具體應用案例見表3。2015年，Zhou等[41]首次利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，成功敲除了毛白楊中木質素合成關鍵基因的定點編輯。2016年，劉婷婷等[42]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)實現(xiàn)了楊樹八氫番茄紅素脫氫酶基因的定點敲除。同年唐雨薇等[43]利用CRISPR雙靶點表達載體獲得了茶樹咖啡堿合成酶編碼基因(TCS)突變體,自此林木基因編輯的大門被打開。越來越多的林木科研學者開始利用CRISPR/Cas系統(tǒng)進行林木基因功能及遺傳改良研究，其中在2019年，Li等[44]利用該技術敲除了毛果楊的PtrADA2b等基因，成功揭示了H3K9ac組蛋白參與干旱脅迫響應的關鍵機制；2019年，Jia等[45]利用CRISPR系統(tǒng)成功編輯了柑橘潰瘍病易感基因CsLOB1，對柑橘的遺傳改良又向前邁進了一步。近年來，CRISPR/Cas系統(tǒng)在林木生長發(fā)育、抗病性、抗蟲害、品質改良及基因功能研究等方面有著越來越廣泛的應用。

表3 利用CRISPR/Ca s系統(tǒng)進行林木改良的案例Tab.3 Examples of forest improvement using CRISPR/Cas system

4 展望

隨著全基因組測序的完成，CRISPR基因編輯技術得到了廣泛應用，在基因功能研究及遺傳改良等方面做出了重大貢獻。對于異源多倍體植物，所有等位基因同時被編輯的概率偏低，因此多倍體植物的高效編輯仍是當前研究的難點。植物花粉培養(yǎng)為多倍體植物的高效編輯提供了一個新的思路，利用基因編輯技術作用于花粉小孢子分化的愈傷組織，再用激素處理使其加倍，該方法可以提高基因編輯在多倍體植物中的編輯效率，縮短獲得純合植物的時間，加速育種的進程，同時該方法還可以排除雜種優(yōu)勢對優(yōu)良品種選擇的影響。

在植物基因功能的研究中，通常多基因共同控制一個性狀，當僅對其中一個基因進行編輯時，該材料往往沒有表型，在這種情況下往往需要對控制該性狀的多個基因都進行編輯。通常傳統(tǒng)的基因編輯技術不能對多個基因同時進行編輯，而二次遺傳轉化的繁殖周期非常漫長，直到CRISPR/Cas系統(tǒng)的出現(xiàn)，這一問題才得到了解決。利用多靶點的CRISPR/Cas系統(tǒng)，可以在T0代獲得多基因同時敲除的突變體植株。這種省時高效的基因突變方法對多基因共同控制的表型研究具有重要意義，同時該系統(tǒng)也為科研工作者提供了更多選擇的機會。另外，多靶點載體系統(tǒng)的使用將對CRISPR/Cas基因編輯技術的應用和推廣起到極大地推動作用?？傊贑RISPR/Cas系統(tǒng)的植物基因編輯技術還存在很多問題，因此發(fā)展更高效精確的基因編輯系統(tǒng)仍是今后發(fā)展的方向。但是毫無疑問，基因編輯技術是未來植物遺傳育種、品質改良的重要途徑。