趙松子，左繼林，幸偉年

（江西省林業(yè)科學(xué)院·江西省油茶種質(zhì)資源保護(hù)與利用實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330013）

植物種子數(shù)量是一個(gè)復(fù)雜的性狀，涉及多個(gè)生物學(xué)過程，胚珠數(shù)量及其育性、雙授精、種子發(fā)育等均可能影響果實(shí)中最終的種子數(shù)量，從遺傳角度，胚、胚乳、細(xì)胞質(zhì)及母本的基因型均可影響種子數(shù)量。種子數(shù)量是普通油茶（Camellia oleifera）的一個(gè)重要產(chǎn)量性狀，單果重與種子數(shù)量（粒數(shù)）呈極顯著正相關(guān)，果高也與種子數(shù)量呈極顯著正相關(guān)[1]。EPF/EPFL基因家族編碼植物特有的分泌多肽激素；成熟的EPF/EPFL多肽有6或8個(gè)半胱氨酸殘基，半胱氨酸殘基間可形成分子內(nèi)的二硫鍵；擬南芥（Arabidopsis thaliana）EPF/EPFL基因家族有11個(gè)基因，水稻（Oryza sativa）有12個(gè)；植物EPF/EPFL基因可分為4個(gè)亞家族：EPF1/2/EPFL7亞家族、EPFL9亞家族、EPFL1/2/3亞家族、EPFL4/5/6/8亞家族[2-4]。在擬南芥中，成熟子房中的胚珠數(shù)量與胚珠原基密度（胚珠原基/胎座長度）、胎座長度相關(guān)，由母本基因型決定，EPFL2（At4;37810，AtEPFL2）功能缺失突變體epfl2-1的胚珠原基密度降低、胚珠原基數(shù)量減少[5]；在水稻中，OsEPFL1（;AD1）影響種子的長度和數(shù)量，gad1的種子數(shù)量增加、長度變短[6-7]；AtEPFL2與OsEPFL1均屬于EPFL1/2/3亞家族[4]，表明該亞家族的基因?qū)ΨN子數(shù)量的影響具有進(jìn)化上的保守性，雙子葉植物中的EPFL2可能具有相同的保守的功能，即參與調(diào)控種子數(shù)量。本研究通過生物信息學(xué)方法，從普通油茶良種‘贛無1’的轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)中鑒定出3個(gè)EPFL2基因，并進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，為深入研究這些基因的生物學(xué)功能及油茶種子數(shù)量性狀變異的分子基礎(chǔ)提供參考。

1 材料與方法

1.1 生物信息學(xué)鑒定

利用BLASTP[8]軟件，以擬南芥的EPFL2蛋白質(zhì)序列分別搜索油茶良種‘贛無1’的幼葉、未成熟種仁、花蕾、根轉(zhuǎn)錄組蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫[9-12]，得到同源基因的部分蛋白質(zhì)序列及其CDS序列，用Boetie2[13]軟件將轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)單讀段比對到CDS序列，根據(jù)讀段編號用自編的Perl腳本提取成對的讀段，在默認(rèn)狀態(tài)下用Cap3軟件[14]進(jìn)行序列拼接，獲得同源基因的mRNA序列；再用Boetie2軟件將轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)單讀段比對到mRNA序列，提取成對的讀段，用Cap3軟件再進(jìn)行序列拼接，獲得新的mRNA序列；重復(fù)上述過程，直到mRNA序列不再延伸。

用油茶EPFL2基因的mRNA序列搜索油茶良種‘贛無1’基因組3代測序數(shù)據(jù)[15]，得到含有油茶EPFL2基因mRNA序列的亞讀段；亞讀段經(jīng)過校正后，用Augustus[16-17]軟件進(jìn)行基因預(yù)測，得到油茶EPFL2基因的全長CDS序列。

1.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

以擬南芥與水稻EPF基因?yàn)閰⒖迹肕E;A7[18-19]軟件對油茶EPFL2基因、植物中已鑒別的EPFL1/2/3亞家族基因進(jìn)行蛋白質(zhì)序列比對，構(gòu)建EPFL1/2/3亞家族蛋白質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)化樹（Maximum Likelihood法，JTT模式）。

2 結(jié)果與分析

2.1 油茶EPFL2基因

以擬南芥的EPFL2基因序列搜索油茶幼葉、未成熟種仁、花蕾、根轉(zhuǎn)錄組蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，得到3條EPFL2的不完整CDS序列；將轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)單讀段比對到油茶EPFL2序列，提取成對讀段，用Cap3軟件進(jìn)行序列拼接，分別獲得油茶EPFL2基因的mRNA序列。

用油茶3條EPFL2基因mRNA序列搜索油茶基因組3代測序數(shù)據(jù)，得到3條亞讀段，亞讀段經(jīng)過校正后，長度分別為39769bp（;enBank登錄號：MZ218071）、44625bp（;enBank登錄號：MZ218072）、48498bp（;enBank登錄號：MZ218073），用Augustus軟件進(jìn)行基因預(yù)測，得到油茶EPFL2基因全長mRNA序列、全長CDS序列及aa序列，其結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的拼接結(jié)果基本一致，3個(gè)基因分別命名為CoEPFL2a、CoEPFL2b、CoEPFL2c。

用在線分析軟件SignalP-5.0[20-21]（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-5.0/）進(jìn)行蛋白信號肽與酶切位點(diǎn)預(yù)測，結(jié)果表明：AtEPFL2、CoEPFL2c含信號肽，信號肽長度分別為28、34個(gè)氨基酸，酶切位點(diǎn)分別在28與29（AN;-RP）、33與34（AE;-RA）個(gè)氨基酸之間，CoEPFL2a、CoEPFL2b不含信號肽。

2.2 植物EPFL1/2/3亞家族蛋白質(zhì)序列進(jìn)化分析

為更好地了解油茶CoEPFL2a、CoEPFL2b、CoEPFL2c的功能，以擬南芥與水稻EPF蛋白質(zhì)序列作為參考，利用ME;A7軟件進(jìn)行植物31個(gè)EPFL1/2/3亞家族蛋白質(zhì)的進(jìn)化分析(表1)。結(jié)果顯示(圖1)，31個(gè)EPFL1/2/3亞家族蛋白質(zhì)分為3個(gè)分支，即EPFL1分支、EPFL2分支、EPFL3分支；OsEPFL1、AtEPFL1屬于EPFL1分支；CoEPFL2a、CoEPFL2b、CoEPFL2c屬于EPFL2分支，并且CoEPFL2a、CoEPFL2c與AtEPFL2在同一個(gè)亞分支。

圖1 植物EPFL1/2/3蛋白質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Maximum likelihood phylogenetic tree of EPFL1/2/3 proteins in plants

表1 系統(tǒng)進(jìn)化樹中的EPF/EPFL蛋白質(zhì)及其編號Tab.1 EPF/EPFL proteins in phylogenetic tree and their accession numbers

3 結(jié)論與討論

本研究利用反向遺傳學(xué)技術(shù)從油茶轉(zhuǎn)錄組蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫和基因組3代測序數(shù)據(jù)中鑒定出了3條與油茶種子數(shù)量相關(guān)的基因，分別為CoEPFL2a、CoEPFL2b、CoEPFL2c；利用ME;A7軟件構(gòu)建了植物EPFL1/2/3亞家族蛋白質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)化樹，CoEPFL2a、CoEPFL2b、CoEPFL2c屬于EPFL2分支，并且CoEPFL2a、CoEPFL2c與AtEPFL2在同一個(gè)亞分支；對AtEPFL2、CoEPFL2a、CoEPFL2b、CoEPFL2c進(jìn)行信號肽與酶切位點(diǎn)預(yù)測，AtEPFL2、CoEPFL2c含信號肽與酶切位點(diǎn)，CoEPFL2a、CoEPFL2b不含；CoEPFL2c可能與AtEPFL2具有同樣的功能，即通過調(diào)節(jié)胚珠原基密度影響種子數(shù)量。

目前，對油茶種子數(shù)量相關(guān)的基因進(jìn)行正向遺傳學(xué)定位、克隆與鑒定需要十余年或更長的時(shí)間才能完成，利用反向遺傳學(xué)技術(shù)可以加快研究進(jìn)程。在油茶種質(zhì)資源中，單果種子數(shù)量差異巨大，如‘白皮中子’為1～4粒、‘贛54’為1～3粒、‘石市紅皮’為2～6粒、‘夏講6號’為4～13粒[1]，為研究油茶種子數(shù)量性狀變異的分子基礎(chǔ)提供了良好的材料，未來將繼續(xù)利用反向遺傳學(xué)技術(shù)鑒定油茶種子數(shù)量相關(guān)基因，并基于這些基因開發(fā)SSR、SNP標(biāo)記，利用油茶種質(zhì)資源群體進(jìn)行基因功能研究，挖掘可以增加種子數(shù)量的等位基因或分子標(biāo)記。