張 瀟，葉雨萌，李 楊

(1. 軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院 輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100036;2. 鄭州大學(xué) 醫(yī)學(xué)科學(xué)院，鄭州 450000)

0 引言

近年來胸部惡性腫瘤的發(fā)病率居高不下，放療是其主要治療手段之一，導(dǎo)致的放射性肺損傷(radiation induced lung injury, RILI)是常見且限制放療劑量甚至應(yīng)用的并發(fā)癥之一，不僅降低腫瘤局部控制率,更嚴重損害患者的生活質(zhì)量,進展至后期往往可危及生命。肺泡上皮細胞(alverlar epithelial cell, AEC)是肺組織RILI的主要靶細胞。RILI過程中細胞凋亡起重要的作用，實質(zhì)細胞(AEC等)的過度凋亡，會導(dǎo)致RILI的發(fā)生，最終導(dǎo)致肺纖維化[1]。DNA是電離輻射(ionizing radiation, IR)的作用靶點，細胞凋亡為DNA損傷的主要結(jié)局之一。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)是DNA損傷后修復(fù)、細胞凋亡和細胞壞死性死亡的“轉(zhuǎn)換點”，三氨基苯甲酰胺(3-Aminobenzamide, 3-AB)是PARP特異的抑制劑[2]。本研究通過離體培養(yǎng)肺泡上皮細胞A549，采用60Co γ射線照射，在照射后的不同時間點，應(yīng)用噻唑藍(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yi)-2,5- diphnytetrazolium bromide, MTT)法、丫啶橙(acridine orange, AO)/嗅化乙錠(ethidium bromide, EB)染色法、磷酸化組蛋白H2AX(phosphorylated H2AX, γ H2AX )的免疫熒光染色等方法檢測細胞增殖活力、細胞凋亡、DNA損傷、AIF和PARP等的表達；并應(yīng)用抑制劑3-AB作用于細胞，采用γ射線照射，免疫印跡檢測AIF的表達。旨在研究γ射線照射對肺泡上皮細胞生物學(xué)行為的影響并初步探討其機制。

1 材料和方法

1.1 實驗用細胞及處理

采用A549肺泡上皮細胞。將A549細胞按照1×104個/mL接種到培養(yǎng)瓶中，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后進行照射，或加入抑制劑3-AB并設(shè)對照組，濃度分別為5 mM、10 mM和20 mM，處理24 h后進行照射。

1.2 細胞照射

采用60Co γ射線照射，單次照射，劑量為5 Gy，劑量率99.34 Gy/min。分別在照射后不同時間點進行各項檢測。

1.3 MTT比色法檢測細胞增殖活力

照射后30 min、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h及72 h檢測細胞增殖活力。將細胞按照1×104個/mL接種于96孔板，次日每孔加入20 μL MTT工作液。4 h后每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min后用多功能酶標儀將波長設(shè)置為490 nm檢測OD值。

1.4 AO/EB染色法檢測細胞凋亡

將A549細胞按照1×104個/mL接種到六孔板中24 h進行照射，于照射后30 min、1 h、3 h、6 h、12 h檢測A594細胞凋亡情況。將AO、EB溶液制備為工作液，將細胞照射后細胞制成爬片并移入到加有AO/EB的培養(yǎng)皿中染色2 min，后將爬片倒扣至潔凈的載玻片上。采用熒光顯微鏡觀察且拍照。將各種類型的細胞進行計數(shù)，并計算出凋亡細胞率。

1.5 γ H2A檢測DNA損傷

照射后30 min、1 h、3 h、6 h、12 h檢測A549細胞DNA損傷。將照射后A549細胞制成爬片。將0.05%胰蛋白酶滴在爬片上15 min，后0.01 mol/1 PBS溶液洗3次。采用10%山羊血清封閉30 min，37℃。滴加γ H2AX(1∶500)滴加在爬片上，4℃ 過夜。后滴加1∶100的熒光二抗，在37℃避光孵育1 h。采用DAPI封片，后采用DM3000B熒光顯微鏡拍照，并計算陽性細胞比例。

1.6 免疫印跡法檢測細胞中AIF的表達

首先提取細胞總蛋白。在A549細胞中加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，每107個細胞需要1 mL。超聲能充分細胞裂解，放在冰上30 min，4℃離心后取上清液，即為細胞蛋白。采用12%分離膠和5%的濃縮膠進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)印于聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride, PVDF)上，在5%脫脂奶粉的TBST液中封閉1 h，再與一抗(1∶1000)4℃孵育過夜。用TBST洗3次，每次10 min，將其與辣根過氧化物酶歐聯(lián)的山羊抗兔IgG抗體室溫孵育1 h，用TBST洗3次，每次10 min，最后用ECL顯色。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 γ射線照射對A549細胞增殖活力的影響

5 Gy γ射線照射A549細胞后3 h、6 h、12 h和72 h，A549細胞增殖活力均較照射前顯著降低，照射后24 h和48 h，細胞增殖活力較照射前均無差異(圖1)。

圖1 5 Gy γ射線照射后不同時間A549細胞增殖活力的變化

2.2 γ射線照射可致A549細胞DNA損傷

5 Gy γ射線照射后30 min、1 h、3 h，與對照組比較，可見較多DNA受損細胞；照射后6 h、12 h γ H2AX焦點陽性細胞減少，但仍顯著多于照射前(圖2A, 2B)。γ射線照射后A549細胞出現(xiàn)DNA損傷的陽性細胞百分比,如圖3所示。

圖2 5 Gy γ射線照射對A549細胞DNA損傷的影響(γ H2AX 的免疫熒光染色、scale bar=20 μm)A：對照組細胞;B：5 Gy照射組

圖3 5 Gy γ射線照射對A549細胞DNA損傷陽性細胞百分比

2.3 γ射線照射對A549細胞凋亡的影響

5 Gy γ射線照射后30 min，可見少量凋亡細胞，與對照組無顯著差異，照射后1 h和 3 h，凋亡的細胞數(shù)較對照組顯著增多，尤以照射后3 h最為顯著，照射后6 h凋亡細胞數(shù)目較3h明顯減少，但仍多于照射后30 min，照射后12 h，凋亡細胞數(shù)目顯著減少與對照組無顯著差異(圖4、圖5)。

圖4 5 Gy γ射線照射對A549細胞凋亡的影響(scale bar=20 μm)

圖5 5 Gy γ射線照射對A549細胞凋亡細胞百分比

2.4 γ射線照射后A549細胞PARP的表達變化

5 Gy γ射線照射后30 min、3 h和12 h，A549細胞的PARP表達較照射前低，尤其以照射后12 h表達降低最為顯著；照射后1 h和6 h，PARP表達較照射前高，以照射后6 h表達增高更為顯著(圖6)。

圖6 5 Gy γ射線照射后A549細胞全長PARP的表達變化

5 Gy γ射線照射后除24 h外的幾個時間點，A549細胞的切割后PARP表達較照射前高，尤其以照射后30 min表達升高最為顯著；照射后24 h，切割后的PARP表達較照射前低(圖7)。

圖7 5 Gy γ射線照射后A549細胞切割后PARP的表達變化

2.5 抑制劑3-AB對照射后A549細胞AIF表達的影響

5 Gy γ射線照射后各時間點 A549細胞AIF的表達均高于照射前，尤以照射后3 h表達增高最為顯著。3-AB處理的A549細胞經(jīng)5 Gy γ射線照射后，除1 h外各時間點AIF表達均顯著低于單純5 Gy γ射線照射組，尤以照射后3 h差異最為顯著(圖8)。

圖8 抑制劑3-AB處理后A549細胞經(jīng)γ射線照射后PARP的表達變化

3 討論

RILI主要包括早期的急性放射性肺炎和晚期的放射性肺纖維化[1]。肺炎經(jīng)有效治療可恢復(fù)，一旦形成放射性肺纖維化，則無法逆轉(zhuǎn)。隨著放療技術(shù)的不斷發(fā)展，RILI的發(fā)生率有所下降，但仍大于15%[3]。近年來，RILI機制在細胞因子及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、miRNA及其他非編碼RNA、粘附因子及免疫失調(diào)等多方面進行了深入的研究，取得了一定得進展，但許多問題又亟待解決。因此，進一步研究RILI機制，對于發(fā)現(xiàn)新的防治靶點具有重要的理論和實際意義。

射線照射可致DNA損傷，DNA損傷有多種類型，其中嚴重的損傷是DNA雙鏈斷裂(DNA double-strand breaks, DSBs)，若不能得到及時準確的修復(fù)，將會引起細胞凋亡，影響基因組穩(wěn)定性，導(dǎo)致染色體缺失及重排，致腫瘤及與年齡相關(guān)的疾病的發(fā)生[4]。Rogakou等[5]于1998年首先發(fā)現(xiàn)經(jīng)IR及藥物處理細胞后，可引起 DNA雙鏈斷裂，從而引起的絲氨酸-谷氨酰胺-谷氨酸結(jié)構(gòu)域中的絲氨酸殘基迅速磷酸化，并將磷酸化的H2AX命名為γ H2AX。研究表明，γ H2AX焦點的形成沒有細胞特異性，并且無論何種因素誘導(dǎo)產(chǎn)生的DSBs都伴隨有H2AX的磷酸化[6]。DSBs可誘導(dǎo)產(chǎn)生γ H2AX，而且γ H2AX和DSBs的量存在對應(yīng)關(guān)系，因此,γ H2AX為經(jīng)典的DSBs標志物。此外，Cande等[7]發(fā)現(xiàn)線粒體調(diào)節(jié)的凋亡通路可由線粒體膜釋放AIF而介導(dǎo)完成，AIF具有促凋亡的作用，其表達升高為凋亡發(fā)生的標志之一。本文主要通過γ H2AX和AIF兩個指標的檢測及AO/EB染色觀察AEC于γ射線照射后DNA損傷和凋亡的發(fā)生。

AEC是肺組織放射損傷的主要靶細胞，AEC凋亡是RILI發(fā)生、發(fā)展的重要始動和維持因素，AEC凋亡后，如果能正常修復(fù)，可恢復(fù)正常肺泡結(jié)構(gòu)和功能，如果AEC持續(xù)發(fā)生凋亡，肺泡上皮結(jié)構(gòu)破壞，將導(dǎo)致肺纖維化的發(fā)生，但RILI進展過程中AEC凋亡的機制尚未闡明。文獻報道γ射線照射所致肺損傷模型中發(fā)現(xiàn)AEC的凋亡[8]。8 Gyγ射線照射離體培養(yǎng)的AEC，其凋亡率為(24.27±1.73)%[9]。本研究選用5 Gy γ射線照射，發(fā)現(xiàn)可抑制A549細胞增殖，導(dǎo)致A549細胞發(fā)生DNA損傷和凋亡，進而以PARP為初步探討其機制。

PARP是DNA損傷后修復(fù)、細胞凋亡和細胞壞死性死亡的“轉(zhuǎn)換點”，可以看作DNA損傷的感受器。有研究報道，小劑量電離輻射可致PARP活化，在DNA損傷修復(fù)中起到重要作用[10]。還有研究報道，由于PARP活性被損傷的DNA激活，PARP將ATP耗竭，引起細胞壞死[11]。提示PARP活性可被損傷的DNA激活，一方面參與DNA修復(fù)，抑制細胞凋亡；另一方面也可致細胞凋亡和壞死。3-AB是PARP的特異性的抑制劑，可通過抑制PARP活性，調(diào)節(jié)DNA損傷和修復(fù)[12]。AIF是定位于線粒體中的黃素蛋白，是非Caspase依賴凋亡途徑的關(guān)鍵介質(zhì)，在損傷部位，AIF從線粒體中釋放并轉(zhuǎn)移至細胞核，引起大規(guī)模DNA斷裂和神經(jīng)細胞凋亡[13-14]。PARP是引發(fā) AIF 從線粒體釋放并轉(zhuǎn)移至細胞核的重要內(nèi)在因素之一[15-16]。PAR介導(dǎo)AIF從線粒體易位到細胞核被認為是過度活化 PARP引起的細胞死亡的原因之一。PAR是一個 PARP以糖苷鍵連接形成的聚合物，主要在細胞核中產(chǎn)生定位于細胞質(zhì)，在線粒體膜上與 AIF結(jié)合，引發(fā) AIF解離和從線粒體釋放，同時轉(zhuǎn)位到細胞核，引發(fā)大規(guī)模 DNA斷裂最終誘導(dǎo)細胞死亡[17-18]。本研究結(jié)果表明，γ射線照射可導(dǎo)致AIF、PARP和活化的PARP表達均升高，應(yīng)用PARP特異性抑制劑3-AB顯著抑制照射導(dǎo)致AEC的凋亡。上述結(jié)果提示，PARP對于輻射所導(dǎo)致的AEC凋亡可能具有正調(diào)控作用，尚有待進一步深入研究。