程兆瑞，程小平，李福堂，陽(yáng)建超，孫誠(chéng)誼，喻 超

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科，貴陽(yáng) 550004；2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，南昌 330006)

肝癌是世界第五大常見(jiàn)癌癥，是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的第三大原因[1]。有研究[2]顯示，晚期肝癌患者總體5年生存率<5%。miRNAs是一類長(zhǎng)度在21～23個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的非編碼RNA[3]。通過(guò)與靶基因結(jié)合減少靶基因的表達(dá)，miRNAs可調(diào)控細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和分化等多種生物學(xué)行為[4]。目前，已有多種miRNAs被發(fā)現(xiàn)與肝癌的發(fā)生、發(fā)展有著密切聯(lián)系：KE等[5]研究發(fā)現(xiàn)，miR-148b在肝癌中呈低表達(dá)且通過(guò)介導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，促進(jìn)肝癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移；WANG等[6]研究顯示，miR-383可通過(guò)靶向IL-17激活STAT3信號(hào)通路，從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡；XU等[7]研究發(fā)現(xiàn)，miR-885-5p在肝癌細(xì)胞中表達(dá)顯著減少，直接靶向HK2調(diào)節(jié)肝癌代謝重編程從而抑制肝癌的增殖和轉(zhuǎn)移。本研究探討miR-4530對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制，為肝癌的治療提供可能的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

高糖DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)均購(gòu)自美國(guó)Gibco生物公司；miR-4530模擬物及陰性對(duì)照模擬物購(gòu)自武漢聚能慧達(dá)生物有限公司；TRIB1(tribbles pseudokinase 1)過(guò)表達(dá)質(zhì)粒購(gòu)自山東維真生物科技有限公司；RT試劑盒、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)相關(guān)SYBRP、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自日本Takara生物技術(shù)有限公司；雙熒光素酶試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；脂質(zhì)體2000、制膠試劑盒、脫脂奶粉和山羊抗兔二抗均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；單克隆兔源性TRIB1抗體和鼠源性GAPDH購(gòu)自美國(guó)CST公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)儀和凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 qRT-PCR檢測(cè)

收集人肝癌細(xì)胞MMC-7721、HepG2、Hep3B和Huh-7細(xì)胞及正常肝細(xì)胞LO2，加入1 mL Trizol，裂解10 min。先后加入氯仿、異丙醇，12 000 r·min-1離心15 min，棄上清。沉淀經(jīng)70%乙醇洗滌后，加入30 mL無(wú)酶水，測(cè)量RNA濃度，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；加入SYBR Green熒光染料，檢測(cè)miR-4530和TRIB1的表達(dá)。其中，miR-4530以U6為內(nèi)參，TRIB1以GAPDH為內(nèi)參，應(yīng)用2-ΔΔct法計(jì)算其在細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

人肝癌細(xì)胞MMC-7721、HepG2、Hep3B和Huh-7細(xì)胞及正常肝細(xì)胞LO2均培養(yǎng)在含10% FBS和1%青鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)皿置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天換液，匯合度達(dá)80%時(shí)傳代并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。miR-4530陰性模擬物(NC mimic組)、miR-4530模擬物(miR-4530 mimic組)、TRIB1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(TRIB1-U組)以及miR-4530過(guò)表達(dá)模擬物聯(lián)合TRIB1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(miR-4530 mimic+TRIB1-U組)均以脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染24 h，qRT-PCR檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染效率。

1.4 細(xì)胞增殖能力檢測(cè)

肝癌細(xì)胞以每孔1000個(gè)鋪入96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。分別于6、24、48及72 h加入10 μL CCK-8檢測(cè)試劑液。培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，在酶標(biāo)儀450 nm處檢測(cè)各孔的吸光度值，根據(jù)吸光度值描繪生存曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞克隆形成能力檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hep3B和Huh-7細(xì)胞(1×103個(gè)·孔-1)接種于六孔板中，培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，待培養(yǎng)的過(guò)夜細(xì)胞完全貼壁后，繼續(xù)培養(yǎng)10 d，棄掉培養(yǎng)基，用PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色30 min，清洗殘余結(jié)晶紫染液，干燥后拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)

利用在線數(shù)據(jù)庫(kù)targetscan(http://www.targetscan.org/vert_72/)鑒定出TRIB1為miR-4530的靶基因之后，構(gòu)建野生型WT-TRIB1和突變型MUT-TRIB1的TRIB1的3′-UTR熒光素酶報(bào)告載體。Hep3B和Huh-7分別以1×104個(gè)鋪于24孔板中，共轉(zhuǎn)染含TRIB1 3′-UTR野生/突變序列的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和陰性對(duì)照/miR-4530模擬物。轉(zhuǎn)染24 h后，收集Hep3B和Huh-7細(xì)胞，根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告試劑盒說(shuō)明書，在熒光定量?jī)x中分別測(cè)定Hep3B和Huh-7細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.7 Western blot實(shí)驗(yàn)

收集細(xì)胞用含1：50的PMSF的RIPA在冰上裂解。4 ℃預(yù)冷離心機(jī)后，以12 000 r·min-1離心15 min，吸取上清蛋白液。用BCA法定量蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸10 min。每孔取30 μg蛋白樣品上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳120 min，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印至PVDF膜120 min，用5%脫脂牛奶封閉120 min，加入TRIB1和GAPDH一抗(1：1000)，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST清洗3次(15 min·次-1)；分別加入相應(yīng)HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗(1：2000)室溫孵育120 min，TBST清洗3次(15 min·次-1)；在暗室中滴加曝光液，曝光顯影，用Image J軟件分析目的條帶。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 miR-4530在肝癌細(xì)胞系和正常肝細(xì)胞中的表達(dá)

miR-4530在LO2、SMMC-7721、HepG2、Hep3B和Huh-7細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.06、0.64±0.12、0.57±0.11、0.43±0.08和0.38±0.04，呈依次降低趨勢(shì)(P<0.05)。選取Hep3B和Huh-7細(xì)胞作為后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)研究。見(jiàn)圖1。

*P<0.05與LO2比較，#P<0.05與Huh-7比較，△P<0.05與SMC7721比較。

2.2 miR-4530轉(zhuǎn)染效率的驗(yàn)證

與轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照模擬物的Hep3B和Huh-7細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染miR-4530模擬物的Hep3B和Huh-7細(xì)胞中miR-4530的表達(dá)明顯增加(P<0.01)，證明構(gòu)建miR-4530過(guò)表達(dá)模擬物成功。見(jiàn)圖2。

*P<0.01與NC mimic組比較。

2.3 過(guò)表達(dá)miR-4530對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)測(cè)定miR-4530對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響，分別于6、24、48和72 h時(shí)間點(diǎn)下測(cè)得吸光度值繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，與NC mimics組相比，24、48及72 h，miR-4530 mimics組顯著抑制肝細(xì)胞Hep3B和Huh-7的增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

*P<0.05與NC mimics組比較。

2.4 過(guò)表達(dá)miR-4530對(duì)肝癌細(xì)胞克隆形成的影響

平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，陰性對(duì)照(NC mimic組)和miR-4530(miR-4530 mimic組)過(guò)表達(dá)Hep3B和Huh-7細(xì)胞，克隆數(shù)分別為(365±37)、(172±34)個(gè)和(387±18)、(198±23)個(gè)，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，這提示過(guò)表達(dá)miR-4530明顯抑制Hep3B和Huh-7細(xì)胞的克隆形成能力。見(jiàn)圖4。

*P<0.05。

2.5 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-4530與TRIB1靶向關(guān)系

在線軟件Targetscan的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，TRIB1的3′-UTR能夠與miR-4530相結(jié)合，被鑒定為miR-4530的作用靶點(diǎn)，見(jiàn)圖5A。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-4530能夠顯著減少含野生型3′-UTR的TRIB1質(zhì)粒的熒光表達(dá)量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖5B。

A:TRIB1的3′-UTR含有miR-4530的互補(bǔ)序列；B:雙分子熒光素酶實(shí)驗(yàn)，*P<0.01與NC mimic組比較。

2.6 過(guò)表達(dá)miR-4530對(duì)TRIB1 mRNA和蛋白水平的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示，與NC mimic組相比，miR-4530 mimic組明顯減少TRIB1的mRNA水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，見(jiàn)圖6A。Western blot結(jié)果顯示，與NC mimic組相比，miR-4530 mimic組明顯減少TRIB1的蛋白水平，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)(圖6B)。

A:miR-4530調(diào)控TRIB1的表達(dá)，*P<0.01與NC mimic組比較；B:TRIB1蛋白的表達(dá)。

2.7 過(guò)表達(dá)TRIB1逆轉(zhuǎn)miR-4530對(duì)肝癌細(xì)胞中TRIB1的抑制作用

構(gòu)建陰性對(duì)照、TRIB1過(guò)表達(dá)、miR-4530以及兩者共同過(guò)表達(dá)Hep3B和Huh-7細(xì)胞。qRT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC mimic組相比，TRIB1過(guò)表達(dá)組細(xì)胞的TRIB1表達(dá)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與miR-4530 mimics組相比，miR-4530+TRIB1共同過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中TRIB1表達(dá)量明顯增加(P<0.01)。見(jiàn)圖7。

A:過(guò)表達(dá)TRIB1逆轉(zhuǎn)miR-4530對(duì)肝癌細(xì)胞TRIB1 mRNA表達(dá)的影響，*P<0.01；B:過(guò)表達(dá)TRIB1逆轉(zhuǎn)miR-4530對(duì)肝癌細(xì)胞TRIB1蛋白表達(dá)的影響。

2.8 過(guò)表達(dá)TRIB1逆轉(zhuǎn)miR-4530對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖抑制

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC mimic組相比，24、48和72 h時(shí)，TRIB1過(guò)表達(dá)組增殖能力明顯增強(qiáng)(P<0.05)；同樣與miR-4530過(guò)表達(dá)組相比，24、48和72 h時(shí)，miR-4530+TRIB1共同過(guò)表達(dá)組的增殖能力明顯增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖8。提示，過(guò)表達(dá)TRIB1明顯逆轉(zhuǎn)miR-4530介導(dǎo)的增殖抑制。

*P<0.05與NC mimic組比較，#P<0.05與miR-4530+TRIB1共同過(guò)表達(dá)組比較。

3 討論

肝癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年攀升。因早期缺乏特異性臨床癥狀導(dǎo)致多數(shù)肝癌患者確診已處于晚期，因此尋找一個(gè)新的診斷及治療方法顯得十分重要[8]。miRNAs為一類內(nèi)源性的非編碼單鏈RNA,可通過(guò)直接結(jié)合其mRNA對(duì)其靶基因進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)[9]。miRNAs的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等過(guò)程有著密切的關(guān)系。miR-4530可被視為多種腫瘤的致癌基因或抑癌基因，包括胰腺癌[10]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[11]、乳腺癌[12]、肺腺癌[13]等。SHAMS等[10]研究表明miR-4530在胰腺癌組織中表達(dá)減少，低表達(dá)miR-4530往往與胰腺癌患者不良預(yù)后相關(guān)；WANG等[11]研究表明miR-4530在人腦膠質(zhì)瘤中顯著下調(diào)，且通過(guò)靶向RTEL1來(lái)抑制人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為；此外，WANG等[12]證明miR-4530通過(guò)直接靶向RUNX2的表達(dá)增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對(duì)新輔助化療的敏感性。KANG等[13]研究顯示，miR-4530可作為長(zhǎng)鏈非編碼GATA6-AS1的ceRNA來(lái)調(diào)控肺腺癌的增殖、凋亡、遷移和侵襲。

本研究通過(guò)qRT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：與正常肝細(xì)胞LO2相比，肝癌細(xì)胞SMMC-7721、HepG2、Hep3B和Huh-7中miR-4530的表達(dá)顯著減少。通過(guò)構(gòu)建miR-4530過(guò)表達(dá)肝癌Hep3B和Huh-7細(xì)胞后，應(yīng)用CCK-8和平板克隆實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-4530能明顯抑制Hep3B和Huh-7細(xì)胞的增殖能力。提示，miR-4530在肝癌中可能扮演著抑癌因子的角色。

TRIB1屬于Trib家族，被歸為假激酶，影響著多種細(xì)胞過(guò)程，如增殖、分化、細(xì)胞周期和細(xì)胞死亡[14]，同樣在癌癥的發(fā)生發(fā)展中也起重要作用，如結(jié)直腸癌[15]、肝癌[16]和前列腺癌[17]等中TRIB1已被鑒定為致癌基因。WANG等[18]研究表明TRIB1在結(jié)腸癌中通過(guò)FAK/Src和ERK途徑激活MMP-2來(lái)促進(jìn)結(jié)直腸細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)。TRIB1在非小細(xì)胞癌中表達(dá)增高，高表達(dá)TRIB1往往預(yù)示著不良預(yù)后[19]；TRIB1在前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)增多，且促進(jìn)前列腺細(xì)胞分泌細(xì)胞因子并誘導(dǎo)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞向M2巨噬細(xì)胞分化[20]。YOSHINO等[21]研究發(fā)現(xiàn)，TRIB1在急性髓系白血病(AML)中表達(dá)上調(diào)，且通過(guò)影響Hoxa9的轉(zhuǎn)錄從而加速AML的發(fā)展。本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法分析發(fā)現(xiàn)，TRIB1被預(yù)測(cè)為miR-4530的可能的靶基因。在肝癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-4530能顯著下調(diào)TRIB1的表達(dá)。最后通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了miR-4530能與TRIB1 3′-UTR直接結(jié)合。同時(shí)，在肝癌細(xì)胞中共同過(guò)表達(dá)miR-4530和TRIB1能夠明顯逆轉(zhuǎn)miR-4530對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖抑制。由此提示，miR-4530抑制肝癌細(xì)胞Hep3B和Huh-7的增殖能力可能是通過(guò)減少TRIB1的表達(dá)介導(dǎo)的。本研究中沒(méi)有對(duì)miR-4530可能的抑癌機(jī)制進(jìn)行深入探索，而是關(guān)注miR-4530對(duì)TRIB1的直接調(diào)控作用。

綜上所述，本研究表明miR-4530在肝癌細(xì)胞中表達(dá)減少，過(guò)表達(dá)miR-4530可以通過(guò)降低TRIB1的表達(dá)顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力。miR-4530和TRIB1可能是診斷肝癌的新的生物標(biāo)志物，也是治療肝癌的有效靶點(diǎn)。尚需進(jìn)一步深入研究miR-4530在其中可能的作用機(jī)制。