丁 億，熊世達，鄧 文，何文瑞，郭 炬

(南昌大學a.研究生院醫(yī)學部2019級；b.研究生院醫(yī)學部2018級;c.第一附屬醫(yī)院泌尿外科，南昌 330006)

腎細胞癌是來源于腎小管上皮細胞的異質(zhì)性癌癥，占所有癌癥發(fā)病率的3%～5%[1]，其組織學亞型有腎透明細胞癌(kidney renal clear cell carcinomas，KIRC)、腎乳頭狀細胞癌和腎嫌色細胞癌。KIRC為主要的組織學亞型，約占所有腎癌患者的70%～75%[2]。臨床上大多數(shù)KIRC患者對長期使用化療或放療易產(chǎn)生耐受，故手術(shù)切除是其目前的主要治療方法。此外，約有1/3的KIRC早期確診患者伴有局部或遠處轉(zhuǎn)移，故雖經(jīng)手術(shù)治療達到臨床治愈，仍約有1/4的患者在術(shù)后隨訪中發(fā)生遠處復發(fā)[3-5]。KIRC患者的復發(fā)和轉(zhuǎn)移與其不良預后相關(guān)[2,6]，因此，尋找新的有效的分子標記物，對改善患者的預后具有重要意義。

有研究[7]指出，Podocan樣1(PODNL1)蛋白具有信號肽，1個富含半胱氨酸的N端簇，21個富含氨基酸的重復基序和1個假定的N-糖基化位點，在蛋白結(jié)構(gòu)上類似于Podocan的蛋白，是富含亮氨酸的小重復蛋白聚糖(SLRPs)家族的成員之一。有研究[8]發(fā)現(xiàn)，PODNL1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中高表達并且能夠影響其生物學功能。然而，關(guān)于PODNL1在KIRC中的表達、與臨床預后的相關(guān)性及分子機制目前尚未見報道。因此，本研究通過數(shù)據(jù)挖掘癌癥基因組圖譜(the Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫，分析PODNL1在KIRC中的表達和預后價值，并利用基因集富集分析(GSEA)預測其可能的分子機制，旨在為KIRC篩選可靠的分子靶標提供線索和依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料來源

從TCGA數(shù)據(jù)庫(http://www.tcga.org/)中下載KIRC的mRNA數(shù)據(jù)和相關(guān)共獲得KIRC患者組織樣本539例，正常組織樣本72例作為對照。使用R 4.0.4軟件提取PODNL1在KIRC組織和正常組織中的表達情況，通過WilCox檢驗比較2組PODNL1的表達；采用WilCox檢驗對72對KIRC組織和正常組織中的PODNL1的表達進行配對差異分析。此外，從下載的臨床數(shù)據(jù)中分別提取患者的臨床資料，包括年齡、性別、生存時間、生存狀態(tài)、腫瘤分級、臨床分期、TNM分期。

1.2 方法

1.2.1 PODNL1的表達及其與KIRC患者預后關(guān)系的分析

根據(jù)PODNL1表達在KIRC組織中表達的中位值，將KIRC患者分為2組：高表達組和低表達組。利用R軟件，通過WilCoxon符號秩檢驗和邏輯回歸分析PODNL1基因表達與患者臨床參數(shù)的關(guān)系，包括腫瘤分級、臨床分期、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)浸潤、遠處轉(zhuǎn)移；采用Kaplan-Meier生存分析2組的總體生存率(overall survival，OS)，采用單因素和多因素Cox回歸分析與患者預后相關(guān)的臨床因素，并分析PODNL1基因在KIRC預后評估中的價值。

1.2.2 實時熒光定量PCR檢測PODNL1基因在各細胞系中的mRNA表達水平

體外培養(yǎng)正常腎小管上皮細胞系HK2和KIRC細胞系A(chǔ)-498、786-O、ACHN、OSRC-2，細胞/組織中總RNA提取試劑(諾唯贊生物科技公司)提取細胞總RNA，HiFiScript cDNA Synthesis Kit(康為世紀生物科技公司)將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，SYBR Green qPCR Master Mix(High ROX)(賽維爾生物科技公司)進行擴增，采用2-△△Ct方法對估計值進行驗證。PODNL1基因引物序列為上游引物：3′-CAACGGTGCTGTGACTCTG-5′；下游引物：3′-CCCTGCCCATGTACCCT-5′。ACTIN引物序列為上游引物：3′-TCTCCCAAGTCCACACAGG-5′；下游引物：3′-GGCACGAAGGCTCATCA-5′。

1.2.3 基因富集分析

基因富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)是一種在基因集的水平上研究微陣列數(shù)據(jù)的計算方法[9]。在本研究中，GSEA被用來確定PODNL1高表達組與低表達組之間的差異。以PODNL1表達作為表型標記，利用GSEA 4.1.0軟件進行KEGG通路富集分析，并將隨機組合次數(shù)設置為1000次。以標準化富集分數(shù)(NES)的絕對值大于1，正常P<0.05和錯誤發(fā)現(xiàn)率小于0.25的基因集為富集標準。

1.2.4 統(tǒng)計學方法

使用R 4.0.4軟件進行數(shù)據(jù)處理。使用WilCox檢驗分析PODNL1在KIRC組織和正常組織中的表達差異；WilCoxon符號秩檢驗和邏輯回歸分析PODNL1與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系；生存分析使用Kaplan-Meier方法；使用單因素Cox回歸分析總生存率(OS)與臨床相關(guān)因素之間的關(guān)系；采用多因素Cox分析，篩選獨立預后因素。用t檢驗比較PODNL1基因在KIRC細胞系和正常細胞系中的表達差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PODNL1在KIRC組織和細胞系中的表達

與正常組織比較，PODNL1在KIRC組織中的表達顯著上調(diào)(P<0.001)。見圖1A。72對配對的KIRC組織和正常組織中PODNL1表達分析亦顯示，PODNL1基因在KIRC組織中的表達顯著上調(diào)(P=0.003)。見圖1B。RT-qPCR結(jié)果顯示，與HK2細胞比較，4種癌細胞系中PODNL1的mRNA相對表達量均更高，差異具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見圖2。

A：PODNL1基因在腎臟正常組織和KIRC組織中的表達比較；B：72對配對的KIRC組織和癌旁組織中PODNL1的表達比較。

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，與HK2細胞比較。

2.2 PODNL1的表達與KIRC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

PODNL1在KIRC患者中的表達與腫瘤分級(P<0.001)、臨床分期(P<0.001)、腫瘤浸潤深度(P<0.001)、淋巴結(jié)浸潤(P=0.001)、遠處轉(zhuǎn)移(P=0.001)均顯著相關(guān)。見圖3。邏輯回歸分析結(jié)果亦顯示PODNL1表達與臨床病理參數(shù)顯著相關(guān)。見表1。

A：腫瘤分級(grade)；B：臨床分期(stage)；C：腫瘤浸潤深度(T)；D：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N)；E：遠處轉(zhuǎn)移(M)。

表1 PODNL1表達與KIRC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 PODNL1表達與患者OS、預后的關(guān)系

Kaplan-Meier生存分析結(jié)果(圖4A)顯示，KIRC組織中高表達組的總體生存率顯著低于低表達組(P<0.001)。單因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，PODNL1的表達、年齡、腫瘤分級(grade)、臨床分期(stage)、TNM分期與患者的生存相關(guān)(均P<0.05)；多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，年齡、腫瘤分級(grade)和PODNL1表達均可作為KIRC預后的獨立風險因子。見表2。

表2 單因素和多因素Cox回歸分析

圖4 PODNL1表達與KIRC患者OS的關(guān)系

2.4 GSEA富集分析

GSEA富集分析結(jié)果顯示，在PODNL1高表達組中，篩選出了9條與細胞黏附和腫瘤發(fā)生相關(guān)的重要信號通路顯著上調(diào)，包括細胞外基質(zhì)受體相互作用、鈣信號通路、局部性粘連、Hh信號通路、P53信號通路，NOTCH信號通路、MAPK信號通路、VEGF信號通路和腫瘤相關(guān)通路。見圖5。

圖5 GSEA富集分析KIRC中PODNL1高表達激活的信號通路

3 討論

富含亮氨酸重復序列的小分子蛋白聚糖家族(SLPRs)是蛋白聚糖的一個特殊亞群，參與細胞生長和信號傳導的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[10]。SLPRs廣泛存在于細胞外基質(zhì)中，在各種癌癥中具有潛在的調(diào)控腫瘤細胞增殖、血管生成和遷移的作用[11-12]。而Podocan樣1(PODNL1)蛋白作為SLRPs的V類成員[13]，2011年首次被發(fā)現(xiàn)其存在于成骨細胞和新形成的骨骼中[7]。近年來，PODNL1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的作用被不少研究者關(guān)注。例如，TENG等[14]指出PODNL1可作為卵巢癌預后的生物標記物。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中PODNL1的表達與患者的預后呈負相關(guān)，并可通過調(diào)節(jié)Akt/mTOR途徑促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖、遷移[8,15-16]。

本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫的分析發(fā)現(xiàn)，PODNL1基因在KIRC組織中表達顯著上調(diào)；同時，本研究發(fā)現(xiàn)PODNL1基因的mRNA表達水平在正常腎小管上皮細胞系顯著低于腎癌細胞系。此外，PODNL1的表達與KIRC患者的腫瘤分級、臨床分期和TNM分期相關(guān)，提示PODNL1參與KIRC的惡性進展；PODNL1的表達與患者的總體生存率呈負相關(guān)，單因素和多因素Cox回歸分析表明PODNL1是KIRC的獨立預后因子，提示PODNL1與患者的預后有關(guān)。而且，利用TCGA數(shù)據(jù)庫下載的數(shù)據(jù)進行GSEA富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多個腫瘤相關(guān)通路在PODNL1高表達組織樣本中均有不同程度的富集。其中，細胞外基質(zhì)受體相互作用已經(jīng)證明參與包括腎癌在內(nèi)的多種癌癥細胞的增殖和侵襲[17]；NOTCH信號通路異常激活后參與維持KIRC的干性功能特性[18]；抑制VEGF途徑是轉(zhuǎn)移性KIRC的分子靶向治療的關(guān)鍵點之一[19]。盡管PODNL1與這些腫瘤信號通路的關(guān)系尚未明確，但GSEA富集分析結(jié)果提示PODNL1高表達可能是促進腎癌細胞增殖和KIRC惡性進展的重要因子。此外，雖然通過上述生物信息學分析顯示PODNL1基因是KIRC的獨立預后分子標記物，但二者之間的確切關(guān)系及PODNL1與KIRC的作用與機制，仍需通過臨床前和臨床實驗進行驗證。

綜上所述，PODNL1基因在KIRC組織中呈高表達，并與KIRC的惡性進展相關(guān)，可能是預測患者預后的分子標記物。