李曉曉，于 倩，陳家豪，王文嬌，李 慧，徐志卿,1c

(1.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院a.神經(jīng)生物學(xué)系、北京神經(jīng)修復(fù)與再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.人體解剖與組織胚胎學(xué)系；c.病理學(xué)系，北京100069；2.天津市第三中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，天津 300170)

應(yīng)激是生物機(jī)體在經(jīng)歷強(qiáng)烈刺激時(shí)所出現(xiàn)的非特異性的全身性適應(yīng)反應(yīng)，可引起神經(jīng)內(nèi)分泌及代謝等的異常，且應(yīng)激和情緒及學(xué)習(xí)記憶等生理機(jī)能密切相關(guān)[1]。束縛應(yīng)激(RES)是一種非損傷性刺激，它與人類(lèi)心身性疾病的過(guò)程十分相似，因此束縛應(yīng)激模型是被大家公認(rèn)的應(yīng)激模型之一[2]。根據(jù)束縛時(shí)間的長(zhǎng)短和次數(shù)，束縛應(yīng)激可分為急性束縛應(yīng)激和慢性束縛應(yīng)激[3]。急性束縛應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致大腦皮質(zhì)區(qū)域分泌的炎性因子增加，可以使大腦功能減退并導(dǎo)致神經(jīng)元的損害[4]。前額葉內(nèi)側(cè)皮層(mPFC)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)調(diào)節(jié)焦慮恐懼及應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵腦區(qū)之一，同時(shí)也是參與應(yīng)激受損的重要腦區(qū)[5-6]。

神經(jīng)肽Y(NPY)是由36個(gè)氨基酸組成的多肽，在不同的物種中具有高度保守性，是一種廣泛分布在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì)。NPY共有6種受體，分別為Y1R、Y2R、Y3R、Y4R、Y5R和Y6R，均屬于G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)，NPY信號(hào)主要通過(guò)結(jié)合和激活NPY受體發(fā)揮作用[7]，NPY受體活化后與抑制性G蛋白Gi耦聯(lián)而抑制腺苷酸環(huán)化酶活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)鈣離子的釋放，其中Y1R和Y2R在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)最為廣泛[8]，是NPY產(chǎn)生抗壓力反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)者。Y4R和Y5R在最近的抑郁癥研究中逐漸受到關(guān)注，有研究[9]表明這2個(gè)受體主要與進(jìn)食及胃腸蠕動(dòng)有關(guān)，其中Y5R在調(diào)節(jié)焦慮狀態(tài)和應(yīng)激反應(yīng)時(shí)發(fā)揮功能，其余3個(gè)受體的研究報(bào)道較少。小膠質(zhì)細(xì)胞(Microglia)是存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多的巨噬細(xì)胞，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮免疫作用，是中樞免疫系統(tǒng)的第一道防線。小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)炎癥發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用[10]，它被激活后能分泌大量促炎細(xì)胞因子，如IL-1β、IL-6和TNF-α，這些炎癥因子的釋放又加劇小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，從而形成惡性循環(huán)[11]。NPY受體與其配體NPY結(jié)合后可以介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞與其他細(xì)胞相互作用[12]，還可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活從而起到抗炎作用[13-14]。

筆者前期研究[15]結(jié)果顯示在慢性大鼠抑郁模型的mPFC腦區(qū)，NPY主要通過(guò)Y2R發(fā)揮抗抑郁作用。但在急性束縛應(yīng)激大鼠模型中，NPY受體相關(guān)研究報(bào)道還很少。因此本研究通過(guò)急性束縛制備大鼠應(yīng)激模型，觀察NPY及其受體以及炎性因子在急性束縛應(yīng)激模型中的表達(dá)和分布，為進(jìn)一步研究NPY及其受體在情緒認(rèn)知疾病中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年雄性SD大鼠，體重180～200 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及藥品

RNeasy Lipid Tissue Mini Kit購(gòu)自QIAGEN公司，SuperScriptⅢ First-Strand和Power UpTMS YBRTMGreen Master Mix購(gòu)自Thermo Fisher公司，NPY及Y5R等實(shí)時(shí)定量PCR引物由生物工程(上海)股份有限公司合成，Y5R及IL-1β抗體購(gòu)自Abcam公司，內(nèi)參β-actin等抗體購(gòu)自Proteintech公司，Iba-1抗體購(gòu)自Novus公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和造模

SD大鼠購(gòu)置后飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部，給予充足飼料及飲用水，飼養(yǎng)密度為3～4 只·籠-1，室溫控制在20～25 ℃，空氣濕度控制在40%～50%，給予12/12 h晝夜節(jié)律，正常飼養(yǎng)3 d，使其適應(yīng)環(huán)境，將適應(yīng)環(huán)境的動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組(CTL組)和急性束縛應(yīng)激組(RES組)。CTL組大鼠正常飼養(yǎng)，RES組進(jìn)行急性束縛應(yīng)激模型制備，方法如下：將大鼠放到束縛盒內(nèi)，依據(jù)大鼠體型大小調(diào)節(jié)擋板的前后位置，最佳束縛強(qiáng)度為大鼠在束縛盒內(nèi)不能轉(zhuǎn)頭，束縛時(shí)間2 h。造模結(jié)束后，將動(dòng)物靜置30 min 后處死。本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物模型建立和處理方法符合首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定NPY及其受體mRNA的表達(dá)

大鼠麻醉后快速斷頭取腦，在RNase-free條件下分離出mPFC和下丘腦，快速液氮冷凍后置于-80 ℃中保存，用于后續(xù)RNA及蛋白的提取。依照RNeasy Lipid Tissue Mini Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行mPFC和下丘腦總RNA的提取，甲醛變性電泳檢測(cè)RNA的完整性、NanoDrop2000測(cè)定RNA的濃度和純度。取1 μg RNA，按照SuperScriptⅢFirst-Strand試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA的合成。設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量PCR引物，引物序列見(jiàn)表1。使用Thermo Fisher公司的SYBR熒光定量試劑盒進(jìn)行基因水平的測(cè)定，反應(yīng)條件如下：60 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min共40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后10 ℃保存。每個(gè)樣品重復(fù)3次，記錄各樣品與內(nèi)參GAPDH的CT值，運(yùn)用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 熒光實(shí)時(shí)定量PCR引物序列

1.2.3 蛋白免疫印記實(shí)驗(yàn)分析NPY受體Y5R及IL-1β蛋白表達(dá)

取冷凍大鼠mPFC和下丘腦提取蛋白，迅速加入適量變形裂解液，勻漿超聲后低溫離心取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度，樣品中加入上樣緩沖液，沸水中煮沸離心取上清，5%的積層膠(80 mV，30 min)和10%分離膠(120 mV，70 min)進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，分別加入一抗Y5R(Rabbit 1:10 000)、IL-1β(Rabbit 1:1000)、β-actin(Mouse 1:5000)、α-tubulin(Mouse 1:10 000)和GAPDH(Rabbit 1:1000)，室溫孵育4 h；洗膜后加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠或山羊抗兔二抗(1:5000)，室溫孵育1 h。洗膜后ECL化學(xué)發(fā)光，經(jīng)顯影和定影后得到顯示條帶的X光片。掃描成像后對(duì)條帶進(jìn)行分析，采用Image J軟件測(cè)出條帶的灰度，計(jì)算出各指標(biāo)與其對(duì)應(yīng)的β-actin等內(nèi)參條帶的灰度比值。

1.2.4 免疫熒光染色檢測(cè)NPY受體Y5R及Iba-I的分布

6%水合氯醛(6 mL·kg-1)腹腔注射麻醉大鼠，4%多聚甲醛(PFA)灌注固定，灌注完成后4%PFA后固定4～6 h，轉(zhuǎn)入30%蔗糖溶液中，4 ℃保存至沉底。干冰速凍后修整得到含有擬切片部位的腦組織塊，參考大鼠腦立體定位圖譜于冰凍切片機(jī)上行矢狀面切片，厚度30 μm，將所得腦組織切片貼在玻片上進(jìn)行免疫熒光化學(xué)染色。3% H2O2溶液室溫打孔10 min，PBS漂洗后加入封閉液，室溫封閉1 h；加入Y5R(Rabbit 1:250)及Iba-I(Goat 1:100)一抗過(guò)夜，漂洗后分別加入555標(biāo)記的驢抗兔IgG(1:1000)和488標(biāo)記的雞抗山羊IgG(1:1000)，室溫避光孵育1 h；加入熒光染料Hoechst33258復(fù)染細(xì)胞核，避光孵育20 min，漂洗后封片，熒光顯微鏡下觀察Y5R及Iba-I在mPFC的染色情況。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 NPY及其受體mRNA在mPFC和下丘腦中的表達(dá)

在mPFC中，RES組Y5R mRNA表達(dá)水平較CTL組顯著降低(P<0.05)，而NPY及其他受體mRNA表達(dá)水平與CTL組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖1。在下丘腦中，RES組NPY及其受體mRNA表達(dá)與CTL組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖2。

CTL組(n=6)，RES組(n=8)；*P<0.05 CTL組與RES組比較。

CTL組(n=6)，RES組(n=8)。

2.2 炎性因子mRNA在mPFC和下丘腦中的表達(dá)

在mPFC中，RES組MHC-Ⅱ mRNA表達(dá)水平較CTL組顯著升高(P<0.05)，說(shuō)明在急性束縛應(yīng)激條件下，靜息狀態(tài)下的小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，見(jiàn)圖3。在下丘腦中，RES組各炎性因子mRNA表達(dá)與CTL組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖4。

CTL組(n=6)，RES組(n=8)；*P<0.05 CTL組與RES組比較。

CTL組(n=6)，RES組(n=8)。

2.3 NPY受體Y5R及炎性因子蛋白在mPFC與下丘腦中的表達(dá)

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，在mPFC中，RES組NPY受體Y5R蛋白表達(dá)較CTL組明顯降低(P<0.05)，炎性因子IL-1β蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在下丘腦中，RES組NPY受體Y5R蛋白和炎性因子IL-1β蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖5—6。

A：Western blot檢測(cè)結(jié)果；B：NPY受體Y5R蛋白表達(dá)；C：炎性因子IL-1β蛋白表達(dá)；CTL組(n=4)，RES組(n=4)；**P<0.01 CTL組與RES組比較。

A：Western blot檢測(cè)結(jié)果；B：NPY受體Y5R蛋白表達(dá)；C：炎性因子IL-1β蛋白表達(dá)；CTL組(n=4)，RES組(n=4)。

2.4 NPY受體Y5R及小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Iba-1的共定位

免疫熒光染色結(jié)果顯示，NPY受體Y5R在大鼠mPFC中廣泛分布，鏡下可見(jiàn)錐形或橢圓狀的神經(jīng)元，細(xì)胞核標(biāo)記為藍(lán)色，Y5R蛋白標(biāo)記為紅色，分布于神經(jīng)元胞膜；RES組NPY受體Y5R的表達(dá)低于對(duì)照組。對(duì)照組小膠質(zhì)細(xì)胞突起細(xì)長(zhǎng)呈分枝狀，處于未激活狀態(tài)；RES組小膠質(zhì)細(xì)胞突起粗短分支減少，呈“阿米巴”樣的激活狀態(tài)，RES組小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Iba-1表達(dá)低于對(duì)照組。但對(duì)照組和RES組均不存在Y5R和Iba-1共定位的現(xiàn)象，見(jiàn)圖7。

圖7 免疫熒光染色結(jié)果

3 討論

急性應(yīng)激是當(dāng)代社會(huì)的一種常見(jiàn)應(yīng)激。在急性束縛應(yīng)激動(dòng)物模型制備中只給與動(dòng)物一次束縛應(yīng)激且束縛時(shí)間較短，常為幾十分鐘到幾小時(shí)。應(yīng)激可以導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素增加(人類(lèi)為皮質(zhì)醇，大鼠為皮質(zhì)酮)，激素的增加又會(huì)引起一系列病理生理過(guò)程。機(jī)體受到應(yīng)激刺激后能激活下丘腦-垂體軸，引起ACTH和CORT的增加，繼而導(dǎo)致后續(xù)炎癥、免疫及行為發(fā)生改變[16]。NPY是分布在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中的具有神經(jīng)保護(hù)作用的內(nèi)源性多肽，NPY可能通過(guò)其受體發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的作用，它與其相應(yīng)受體結(jié)合后能夠影響下游多條信號(hào)通路[17-18]。

本研究結(jié)果顯示，NPY受體Y5R的mRNA水平在RES大鼠mPFC顯著性下降，而在下丘腦卻無(wú)變化，說(shuō)明NPY受體Y5R呈現(xiàn)區(qū)域特異性降低；進(jìn)一步的WB結(jié)果顯示NPY受體Y5R蛋白水平也顯著降低，而下丘腦NPY受體Y5R蛋白水平無(wú)變化，因此mPFC是RES大鼠模型的關(guān)鍵腦區(qū)。Y5R的表達(dá)在mPFC中顯著降低，表明其參與了急性束縛應(yīng)激的病理過(guò)程。筆者前期研究[15]結(jié)果顯示，在LPS模型的mPFC腦區(qū)，NPY受體Y2R可通過(guò)抑制M1型小膠質(zhì)細(xì)胞的NLRP3炎性信號(hào)通路發(fā)揮抗抑郁作用。但在急性束縛應(yīng)激大鼠模型mPFC腦區(qū)炎性因子的變化，及降低的Y5R參與束縛應(yīng)激的病理機(jī)制是否與小膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)炎性相關(guān)尚未見(jiàn)報(bào)道。

mPFC是與壓力、認(rèn)知、情緒障礙等密切相關(guān)的腦區(qū)，它可以將情緒信息轉(zhuǎn)化為應(yīng)激行為，是神經(jīng)炎性反應(yīng)的關(guān)鍵腦區(qū)[19]。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮免疫作用的主要細(xì)胞，在外界刺激的作用下，靜息態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞分化為M1-型小膠質(zhì)細(xì)胞，CD11b、Iba-1和MHC-Ⅱ是M1-型小膠質(zhì)細(xì)胞的表面標(biāo)志物，小膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)分泌IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性因子起到致炎性的作用[20]。本研究結(jié)果顯示，在mPFC中，小膠質(zhì)細(xì)胞的表面標(biāo)志物MHC-Ⅱ的mRNA水平升高，表明小膠質(zhì)細(xì)胞被激活；下丘腦的小膠質(zhì)細(xì)胞的表面標(biāo)志物卻無(wú)變化。mPFC炎性因子蛋白水平的變化與mRNA水平的變化不一致，推測(cè)可能是因?yàn)檎婧嘶虮磉_(dá)在轉(zhuǎn)錄和翻譯即mRNA和蛋白兩個(gè)水平層面存在時(shí)間和位點(diǎn)的時(shí)空間隔；轉(zhuǎn)錄后加工、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的降解及翻譯后加工修飾等層面使得轉(zhuǎn)錄和翻譯并不完全一致；再者由于檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)的不同，因?yàn)榧毙允`應(yīng)激模型造模時(shí)間比較短，當(dāng)炎性因子的mRNA水平達(dá)到峰值的時(shí)候，蛋白水平還在增加中，所以出現(xiàn)炎性因子mRNA和蛋白水平表達(dá)不同步的現(xiàn)象。

小膠質(zhì)細(xì)胞表面表達(dá)有多種神經(jīng)肽及神經(jīng)遞質(zhì)受體，這為研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)肽及受體家族對(duì)神經(jīng)炎性的調(diào)控作用提供依據(jù)。在急性束縛應(yīng)激大鼠模型中，Y5R和小膠質(zhì)細(xì)胞之間是否存在一定關(guān)聯(lián)，本研究通過(guò)免疫熒光染色來(lái)進(jìn)一步鑒定，結(jié)果證實(shí)Y5R和小膠質(zhì)細(xì)胞的表面標(biāo)志物Iba-1不存在共定位的情況，說(shuō)明在急性束縛應(yīng)激大鼠模型中，Y5R不是通過(guò)小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮神經(jīng)炎性的調(diào)控作用。有研究[21]報(bào)道，在培養(yǎng)的基底外側(cè)杏仁核神經(jīng)元腦片，NPY的反復(fù)刺激導(dǎo)致興奮性的輸出持續(xù)衰減，誘導(dǎo)樹(shù)突發(fā)育不良，這是通過(guò)NPY激活Y5R實(shí)現(xiàn)。這提示在急性束縛應(yīng)激大鼠模型中，Y5R的作用機(jī)制可能與突觸可塑性等有關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明急性束縛應(yīng)激大鼠mPFC腦區(qū)NPY受體Y5R的表達(dá)下降，急性應(yīng)激導(dǎo)致炎性因子mRNA水平出現(xiàn)變化，但蛋白水平的變化沒(méi)有顯著差異。本研究首次證實(shí)Y5R和小膠質(zhì)細(xì)胞的表面標(biāo)志物Iba-1不存在共定位，推測(cè)Y5R的作用機(jī)制可能與突觸可塑性相關(guān)，但具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。