（福建省中醫(yī)藥科學(xué)院基礎(chǔ)研究室，福建 福州 350003）

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal Osteoporosis，PMOP）是一種與衰老有關(guān)的常見病，主要發(fā)生在絕經(jīng)后婦女，是以骨量減少、骨的微觀結(jié)構(gòu)退化為特征，導(dǎo)致骨脆性增加，易于發(fā)生骨折的一種全身性骨骼疾病。研究顯示，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥以腎陰虛為主[1，2]。前期研究發(fā)現(xiàn)[1]，CLCF1 是PMOP 腎陰虛證的關(guān)聯(lián)基因，CLCF1 在PMOP 腎陰虛證組的表達(dá)水平明顯低于健康對(duì)照組，但其失調(diào)的原因尚未可知。女性絕經(jīng)后雌激素水平下降，骨偶聯(lián)過程失調(diào)，這是PMOP 發(fā)生的主要原因[3]。雌激素在維持骨代謝動(dòng)態(tài)平衡方面扮演著非常重要的角色，PMOP 腎陰虛證患者雌激素水平對(duì)CLCF1 基因表達(dá)是否有影響，目前尚未見報(bào)道。因此本研究通過體外觀察17β-雌二醇對(duì)MG-63 細(xì)胞CLCF1 表達(dá)的影響，旨在揭示CLCF1 基因在PMOP 腎陰虛證的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 本實(shí)驗(yàn)于2019 年4 月～2020 年8月在福建省中醫(yī)藥科學(xué)院完成。人骨肉瘤細(xì)胞MG-63 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，主要試劑包括無酚紅a-MEM 培養(yǎng)基（Thermo fisher 公司）、胰酶（Hyclone 公司）、胎牛血清FBS、牛血清白蛋白BSA（Sigma 公司）、17β-雌二醇（MCE）、雌激素受體抑制劑氟維司群（MCE 公司）、Dual-Luciferase Reporter Assay System（Promega 公司）。主要儀器涉及酶標(biāo)儀（Tecan 公司，Infinite M1000），實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（ABI 公司，7500 FAST）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇凍存的MG-63 細(xì)胞，培養(yǎng)液為10%的無酚紅a-MEM 培養(yǎng)基，按105 細(xì)胞量接種于6 孔板中，于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。24 h 后改用0.1% BSA 的無血清培養(yǎng)3 h 使細(xì)胞同步化。

1.2.2 干預(yù)實(shí)驗(yàn) 將骨肉瘤細(xì)胞MG-63 分為對(duì)照組、β-雌二醇低、中、高劑量組。對(duì)照組加入10-3mol/L DMSO，將17β-雌二醇用DMSO 稀釋后，分別加入β-雌二醇低、中、高劑量組，終濃度分別為10-10、10-9、10-8mol/L。干預(yù)24、48、72 h 分別后消化細(xì)胞，采用ABI 7500 Real time PCR 檢測(cè)樣本中mRNA 的表達(dá)情況。用2-△△Ct法分析基因的表達(dá)情況。

1.2.3 構(gòu)建載體及轉(zhuǎn)染 PCR 擴(kuò)增目的基因CLCF1，酶切pGL3-basic 質(zhì)粒后，回收載體片段。將目的基因與載體片段同源重組后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。用菌落PCR 鑒定轉(zhuǎn)化子，篩選出陽(yáng)性克隆，送測(cè)序。測(cè)序無誤的克隆進(jìn)行質(zhì)粒抽提。將MG63 細(xì)胞接種到6 孔板，12 h 后轉(zhuǎn)染。分別加入10-3mol/L DMSO，10-8mol/L 17β，10-8mol/L 17β-雌二醇+10-7mol/L 雌激素受體抑制劑ICI。

1.2.4 雙熒光素酶活性檢測(cè) 轉(zhuǎn)染24 h 后，棄去培養(yǎng)基，用PBS 清洗后，每孔加入300 μl 的PLB 細(xì)胞裂解液，室溫振搖15 min 使之裂解。在96 孔板中每孔加20 μl 預(yù)先混好的Luciferase Assay ReagentⅡ，再加入細(xì)胞裂解液上清30 μl，2 s 后測(cè)數(shù)據(jù)。之后立即加入20 μl 終止反應(yīng)試劑，靜止2 s 后，用酶標(biāo)儀進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，當(dāng)方差齊時(shí)，選用LSD-t 檢驗(yàn)，當(dāng)方差不齊時(shí)，選用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組CLCF1 基因表達(dá)比較 熒光定量PCR 顯示，干預(yù)24 h 后，β-雌二醇低、中、高劑量組CLCF1的表達(dá)分別是對(duì)照組的8.21 倍、9.67 倍、10.07 倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。干預(yù)48 h 后，β-雌二醇低、中、高劑量組CLCF1 的表達(dá)分別是對(duì)照組的0.93 倍、1.26 倍、2.1 倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2；干預(yù)72 h 后，β-雌二醇低、中、高劑量組CLCF1 的表達(dá)分別是對(duì)照組的0.48 倍、0.95倍、1.38 倍，見圖3，其中β-雌二醇低劑量組與對(duì)照組比較，表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），β-雌二醇中、高劑量組與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

圖1 干預(yù)24 h 各組CLCF1 基因表達(dá)比較

圖2 干預(yù)48 h 各組CLCF1 基因表達(dá)比較

圖3 干預(yù)72 h 各組CLCF1 基因表達(dá)比較

表1 各組CLCF1 基因表達(dá)比較（）

表1 各組CLCF1 基因表達(dá)比較（）

2.2 轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性比較 與對(duì)照組相比，17β-雌二醇高劑量組熒光素酶活性提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；加入雌激素受體抑制劑ICI 后，熒光素酶活性較對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2、圖4。

表2 轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性（）

表2 轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性（）

圖4 轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性

3 討論

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是老年常見多發(fā)病。女性絕經(jīng)后卵巢功能衰退，雌激素水平下降，目前研究證實(shí)雌激素可通過多條信號(hào)通路影響骨骼的生長(zhǎng)和重構(gòu)，如MEK/ERK 信號(hào)通路[4]、NF-κB 信號(hào)通路[5]、FasL 信號(hào)通路[6]等，其作用機(jī)制復(fù)雜，且內(nèi)在機(jī)理尚未完全闡明。前期研究發(fā)現(xiàn)CLCF1 是PMOP 腎陰虛證的關(guān)聯(lián)基因，PMOP 腎陰虛證組CLCF1 表達(dá)水平明顯降低。PMOP 腎陰虛證患者雌激素和CLCF1 水平同時(shí)降低，然而關(guān)于雌激素和CLCF1 之間的關(guān)系報(bào)道較少。

本研究顯示，分別用10-10、10-9、10-8mol/L 17β-雌二醇干預(yù)MG63 細(xì)胞24 h 后，CLCF1 的表達(dá)分別是對(duì)照組的8.21 倍、9.67 倍、10.07 倍，說明三個(gè)濃度均能促進(jìn)CLCF1 的表達(dá)，且隨著濃度上升，CLCF1 表達(dá)呈劑量依賴性，以10-8mol/L 17β-雌二醇促進(jìn)作用最明顯；干預(yù)48h 后，加入10-10、10-9、10-8mol/L 17β-雌二醇的MG63 細(xì)胞CLCF1 的表達(dá)分別是對(duì)照組的0.93 倍、1.26 倍、2.1 倍，其中10-8mol/L 17β-雌二醇可以促進(jìn)CLCF1 基因的表達(dá)，但與24 h 相比，促進(jìn)作用已經(jīng)減弱；干預(yù)72 h后，低、中、高三個(gè)劑量組CLCF1 的表達(dá)分別是對(duì)照組的0.48 倍、0.95 倍、1.38 倍，其中β-雌二醇低劑量組與對(duì)照組比較，表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），β-雌二醇中、高劑量組與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明17β-雌二醇作用72 h后，對(duì)CLCF1 基因已經(jīng)沒有促進(jìn)作用，甚至出現(xiàn)了抑制作用。因此可以確定篩出最佳條件：10-8mol/L 17β-雌二醇作用MG63 細(xì)胞24 h，對(duì)CLCF1 基因表達(dá)的促進(jìn)作用最高。本研究還顯示，10-8mol/L 17β-雌二醇組熒光素酶活性高于對(duì)照組，說明17β-雌二醇可以提高CLCF1 基因的啟動(dòng)子活性；當(dāng)17β-雌二醇加上雌激素受體抑制劑后，熒光素酶活性降低，推斷雌激素受體抑制劑與17β-雌二醇聯(lián)合作用可阻斷17β-雌二醇的作用，進(jìn)一步驗(yàn)證了17β-雌二醇可以提高CLCF1 基因的啟動(dòng)子活性。

CLCF1 為重組心肌營(yíng)養(yǎng)素樣細(xì)胞因子1 基因表達(dá)的蛋白，是糖蛋白（gp）130 因子家族成員之一，是一種強(qiáng)效神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、B 細(xì)胞刺激因子。它主要存在于淋巴結(jié)和脾臟。CLCF1 可通過gp130 受體刺激B 細(xì)胞活化，參與體液免疫，是人體免疫方面的重要基因[7，8]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，CLCF1 可通過調(diào)控JAK2/STAT3 蛋白、磷酸化水平，達(dá)到調(diào)控骨代謝的目的[9]。JAK2/STAT3 信號(hào)通路廣泛參與細(xì)胞增殖、分化以及免疫調(diào)節(jié)等，是眾多細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑，參與多種細(xì)胞因子對(duì)骨代謝的調(diào)節(jié)[10-12]。有研究[13，14]表明JAK2/STAT3 信號(hào)通路可能是細(xì)胞因子調(diào)控RANKL 誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化重要的分子途徑，雌激素可以激活JAK2/STAT3 信號(hào)通路。鑒于CLCF1 和雌激素都可以激活JAK2/STAT3 信號(hào)通路，本研究證實(shí)17β-雌二醇可以促進(jìn)CLCF1 基因的表達(dá)，故推測(cè)17β-雌二醇可能通過CLCF1 激活JAK2/STAT3 通路，達(dá)到調(diào)控骨代謝的目的，這可能也是骨質(zhì)疏松癥腎陰虛證的分子機(jī)制之一。但是17β-雌二醇如何調(diào)控CLCF1 基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥腎陰虛證，還需要進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，17β-雌二醇可通過提高CLCF1 啟動(dòng)子活性促進(jìn)MG63 細(xì)胞株CLCF1 基因的表達(dá)，這可能是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥腎陰虛證的分子機(jī)制之一。