謝佳芮，寇美玲，苗海生

(云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院/云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

分離和鑒定病原體是診斷感染性疾病的傳統(tǒng)策略和金標(biāo)準(zhǔn)方法，也是開展后續(xù)研究的基礎(chǔ)，但需要專業(yè)資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室和技術(shù)人員，且耗時(shí)耗力，在操作人獸共患病原體時(shí)還存在較高的生物危害風(fēng)險(xiǎn)。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)為代表的核酸擴(kuò)增技術(shù)，如實(shí)時(shí)(定量)PCR、多重PCR、免疫捕獲PCR和PCR-ELISA，憑借其高準(zhǔn)確性，正在成為替代病原分離的重要診斷手段。然而，PCR技術(shù)存在一些固有的缺點(diǎn)，即需要精密的核酸擴(kuò)增儀才能實(shí)現(xiàn)在不同時(shí)間維持所需的不同溫度，常規(guī)PCR還需要電泳分析擴(kuò)增結(jié)果。世界衛(wèi)生組織認(rèn)為，理想的診斷檢測(cè)技術(shù)應(yīng)是敏感性高、特異性強(qiáng)、使用成本低、操作簡(jiǎn)單快捷、可用于任何環(huán)境條件下同時(shí)容易獲得操作儀器[1]。因此，發(fā)展和使用快速、可視化的現(xiàn)場(chǎng)診斷技術(shù)，對(duì)防控疫病具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，也是當(dāng)前的重點(diǎn)研發(fā)方向。為克服PCR技術(shù)的短板，Notomi等[2]2000年發(fā)明環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)，因其易于操作，有望作為替代PCR技術(shù)的分子診斷工具[3]引起研究人員的廣泛興趣。經(jīng)過20年的發(fā)展和完善，LAMP技術(shù)已有重要進(jìn)展，有必要做一個(gè)回顧評(píng)價(jià)。

1 LAMP技術(shù)原理

LAMP仍是基于核酸擴(kuò)增的分子診斷技術(shù)，但區(qū)別于傳統(tǒng)的方法，其核心和特別之處是使用一種鏈置換DNA聚合酶(BstDNA polymerase)和2對(duì)引物(也可以是3對(duì)引物)進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)。BstDNA聚合酶是一種基因工程酶，由大腸桿菌(E.coli)菌株產(chǎn)生，因其含有來自嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)DNA聚合酶的基因(該基因缺失了5′→ 3′外切核酸酶結(jié)構(gòu)域)，同時(shí)將麥芽糖結(jié)合蛋白(maltose-binding protein，MBP) 基因與該基因融合表達(dá)。它具有5′→ 3′ DNA聚合酶活性，但不具有5′→ 3′外切核酸酶活性。因此，BstDNA聚合酶具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性和鏈置換活性[4]。其次通過設(shè)計(jì)2對(duì)特殊引物，1對(duì)內(nèi)引物(FIP、BIP)和1對(duì)外引物(F3、B3)，還可額外添加1對(duì)加速環(huán)引物(LF、LB，縮短反應(yīng)時(shí)間)對(duì)靶序列上的6個(gè)獨(dú)立區(qū)域進(jìn)行特異性識(shí)別。由于DNA復(fù)性以及延伸的溫度是恒定的，所以在恒溫條件下，如65 ℃孵育45～60 min，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng),反應(yīng)結(jié)束后，可直接靠副產(chǎn)物焦磷酸鎂的沉淀濁度進(jìn)行判斷，也可以添加熒光染料、或其他核酸染劑進(jìn)行顯色后觀察[5]。

LAMP反應(yīng)為三步驟：第一階段為起始模板合成，由1對(duì)外引物(F3，B3)擴(kuò)增出反應(yīng)的起始模板，外部引物限定了擴(kuò)增的范圍，同時(shí)為內(nèi)部引物的擴(kuò)增提供模板。第二階段為啞鈴狀結(jié)構(gòu)生成階段，內(nèi)引物擴(kuò)增合成的DNA片段含有和該引物5′端DNA 片段的反向互補(bǔ)序列，所以反向互補(bǔ)序列之間雜交形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，另外1條內(nèi)引物與其互補(bǔ)鏈退火雜交后發(fā)生鏈置換合成反應(yīng)，在擴(kuò)增的DNA片段的另外一端形成1個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，2個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)共同形成1個(gè)啞鈴狀結(jié)構(gòu)。第三階段為循環(huán)擴(kuò)增階段，以形成的啞鈴結(jié)構(gòu)為起始反應(yīng)物模板，進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增，雙鏈DNA復(fù)性及延伸的中間溫度是60～65 ℃，在65 ℃左右的時(shí)候，DNA處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，因此，鏈置換DNA合成在不停地自我循環(huán)，1 h即可完成擴(kuò)增反應(yīng)[6]。

2 LAMP技術(shù)特點(diǎn)

2.1 LAMP技術(shù)具備高效簡(jiǎn)便性

PCR、熒光定量PCR技術(shù)，通常需要1.5～2.0 h完成，LAMP反應(yīng)沒有退火、復(fù)性、延伸過程，30～60 min內(nèi)即可完成109～1010個(gè)數(shù)量級(jí)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)[6]。此外，LAMP 檢測(cè)僅需一個(gè)簡(jiǎn)單的恒溫儀器，降低成本，簡(jiǎn)化了操作步驟。同時(shí)，反應(yīng)的結(jié)果判定不需電泳，可直接根據(jù)染料的顏色變化判定結(jié)果。由于一些待檢樣品，比如體液、全血，血液培養(yǎng)基中含有抗凝劑、N-乙酰半胱氨酸或抗補(bǔ)體化合物等可以抑制Taq聚合酶活性，因此PCR不能直接檢測(cè)未提核酸樣品，但LAMP反應(yīng)酶即使存在反應(yīng)抑制劑的情況下也能夠保持其活性，可耐受這些成分，從而使得該測(cè)定方法可以在現(xiàn)場(chǎng)直接進(jìn)行而無需從樣品中提取核酸[7]。

2.2 LAMP技術(shù)具備敏感性

一些病原體檢測(cè)，LAMP 檢測(cè)方法達(dá)到甚至超過實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)水平，比傳統(tǒng)的PCR方法高 2～5 個(gè)數(shù)量級(jí)，有報(bào)道指出最低可檢測(cè)10個(gè)基因拷貝或更低的檢測(cè)限[8-9]，證明比常規(guī)方法具有更好的敏感性[6]。

2.3 LAMP技術(shù)可靠性強(qiáng)

Ji等[10]使用LAMP法檢測(cè)鴨乙肝病毒，結(jié)果顯示，qPCR對(duì)69份臨床組織樣品和88份血清樣品檢測(cè)為陽性，并且LAMP檢測(cè)法和qPCR 100%一致。Kato等[11]使用LAMP法和PCR法，對(duì)大黃蜂中寄生的微孢子蟲同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，均可使用10 pg模板DNA來檢測(cè)微孢子蟲，2種方法顯示出相同的靈敏度和檢測(cè)的一致性。在查閱大量的文獻(xiàn)資料后，2018年以來，LAMP技術(shù)在對(duì)禽腺病毒(FAV)[12]、鵝星狀病毒(GAstVs)[13]、流感病毒 (IV)[14]等領(lǐng)域的研究結(jié)果都充分說明， LAMP技術(shù)可靠性強(qiáng)，檢測(cè)結(jié)果與PCR、qRCR相比無較大差異，比傳統(tǒng)方法特異性強(qiáng)，靈敏度高。

2.4 LAMP技術(shù)具備高特異性

類似巢式PCR，LAMP因有4條特異性引物針對(duì)靶基因序列的6個(gè)區(qū)域，嚴(yán)格高效的引物匹配，有任何一處不匹配皆不能進(jìn)行反應(yīng)，因此極少出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增的情況，同時(shí)不受與靶DNA相似度高的非靶DNA及PCR抑制劑的影響。理論上LAMP法擴(kuò)增的特異性很高，只要通過判定能否擴(kuò)增靶基因，就能夠?qū)Σ≡w進(jìn)行定性檢測(cè)。且針對(duì)同一病原體的不同血清型設(shè)計(jì)專門的擴(kuò)增引物，對(duì)多血清型的同一病原體進(jìn)行定性檢測(cè)而不出現(xiàn)假陽性[15]。

2.5 LAMP技術(shù)的缺點(diǎn)

首先，LAMP反應(yīng)的引物設(shè)計(jì)較復(fù)雜，要求較高。2條內(nèi)引物(FIP、BIP)、2條外引物(F3、B3)、2條加速引物(LoopF、LoopB)。針對(duì)靶基因上6段不同的區(qū)域，位置嚴(yán)苛，只能單向與靶基因結(jié)合；LoopF、LoopB 必須分別在F1、F2和B1、B2 之間；FIP、BIP的長度一般會(huì)大于40 bp，易形成引物二聚體[16]。通常需要對(duì)引物的種類、濃度、反應(yīng)溫度和時(shí)間做優(yōu)化處理。其次，由于LAMP擴(kuò)增后得到的產(chǎn)物是多條大的DNA鏈，這些大分子的DNA鏈非常穩(wěn)定，且不易降解，會(huì)形成氣溶膠污染。同時(shí)由于LAMP技術(shù)很靈敏，少量的陽性污染物會(huì)造成假陽性結(jié)果，這對(duì)操作人員提出了較高的要求。LAMP技術(shù)擴(kuò)增產(chǎn)物，不適于除鑒定外的其他分子生物學(xué)目的，通用性較PCR低，在分子生物學(xué)使用的歷程上較短，現(xiàn)階段應(yīng)用于快速檢測(cè)的方面較為合適，與常規(guī)PCR相比，在穩(wěn)定性方面有一定的差距。

3 LAMP技術(shù)染料及輔助劑的研究進(jìn)展

3.1 LAMP技術(shù)染料

SYBR Green I是一種熒光染料，反應(yīng)結(jié)果陽性時(shí)體系呈綠色，陰性體系呈橙色，肉眼就可觀察反應(yīng)結(jié)果，也可置于紫外燈下觀察反應(yīng)結(jié)果。但熒光染料的使用具有兩面性，使用不同的核酸染料會(huì)對(duì)LAMP反應(yīng)造成一定的影響。若是反應(yīng)前加入，由于熒光染料對(duì)DNA分子的高結(jié)合力和親和力(因?yàn)闊晒馊玖蠒?huì)與DNA雙鏈結(jié)合，一旦結(jié)合其熒光信號(hào)會(huì)增強(qiáng)800～1 000倍)，從而阻礙BstDNA聚合酶鏈置換活性[17]。反應(yīng)結(jié)束后開蓋加入，存在氣溶膠污染，從而造成假陽性。反應(yīng)前將SYBR Green I滴加于反應(yīng)管的蓋上，反應(yīng)結(jié)束后，將染料彈入或離心與反應(yīng)體系混勻，這種操作方式避免了對(duì)反應(yīng)效率的影響以及產(chǎn)生氣溶膠污染[18]。但此種操作方式需要在特定的情況下使用，防止溫度過高，染料凝固，適用于水浴鍋或者是PCR儀不開熱蓋的模式。使用SYBR Green I，并不能做到特異性的顯示擴(kuò)增產(chǎn)物，引物二聚體或非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物也能結(jié)合熒光染料顯色，易造成假陽性，對(duì)引物的設(shè)計(jì)要求較嚴(yán)格[19]。

鈣黃綠素是一種金屬離子指示劑，它與Mn2+離子結(jié)合時(shí)處于熒光淬滅狀態(tài)，當(dāng)隨著大量DNA雙鏈的合成，反應(yīng)體系當(dāng)中產(chǎn)生的焦磷酸根離子副產(chǎn)物，使得Mn2+離子與磷酸根結(jié)合而解除淬滅狀態(tài)發(fā)出熒光。但在2010年，Wastling等[4]發(fā)現(xiàn)，與沒有添加指示劑的反應(yīng)相比，加入鈣黃綠素似乎降低了LAMP的敏感性。實(shí)際上，鈣綠黃素的使用對(duì)反應(yīng)體系當(dāng)中的Mg2+的濃度要求很高，有一定的偏差，都會(huì)造成反應(yīng)結(jié)果誤差。鈣黃綠素在一定程度上抑制了LAMP反應(yīng)，另一個(gè)原因是鈣黃綠素和雙鏈DNA之間的相互作用導(dǎo)致了反應(yīng)靈敏度的降低[20]。

羥基萘酚藍(lán)(HNB)也是一種金屬離子指示劑，可與反應(yīng)體系當(dāng)中的Mg2+結(jié)合而成紫羅蘭色，當(dāng)DNA雙鏈合成后，生成焦磷酸鎂，失去鎂離子的HNB就變成了天藍(lán)色，羥基萘酚藍(lán)對(duì)LAMP反應(yīng)體系不存在抑制和影響[21]。但是該種染料在紫外燈下顏色區(qū)分不明顯，且無成品化試劑，進(jìn)行反應(yīng)時(shí)需要按照一定濃度現(xiàn)用現(xiàn)配，且HNB不穩(wěn)定，不容易保存，使用不便[22]。另一個(gè)問題是HNB的顏色反應(yīng)肉眼區(qū)別不明顯，不容易察覺顏色變化，雖然目前很多研究者在使用本方法，但并沒有獲得大家的認(rèn)可[23]。

PicoGreen的熒光增色效果非常明顯，未結(jié)合雙鏈DNA(dsDNA)的染料幾乎沒有熒光。與DNA結(jié)合后，嵌入的影響和靜電相互作用固定了染料分子，導(dǎo)致其熒光增強(qiáng)了1 000倍[24]。其次，PicoGreen染料可在25～1 000 μg/L的范圍內(nèi)定量反應(yīng)體系中的雙鏈DNA，不容易受到RNA和單鏈DNA的影響，傳統(tǒng)的染料只能檢測(cè)DNA和RNA的混合濃度。在提取DNA和RNA時(shí)，會(huì)有一些酚類、蛋白和氯仿等物質(zhì)的殘留，但是PicoGreen對(duì)DNA的檢測(cè)不受此類殘留物質(zhì)的影響，具有較好的精確性和可靠性，操作簡(jiǎn)便、干擾因素少[25]。

3.2 LAMP技術(shù)輔助劑

甜菜堿：可以使靶基因序列上富含GC的區(qū)域水合作用提高，降低堿基堆積力，一定程度上影響了DNA的分子結(jié)構(gòu)，增強(qiáng) DNA 聚合酶的穩(wěn)定性，幫助其順利沿模板延伸[26]。Spiess等[26]發(fā)現(xiàn)，甜菜堿通過減少RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，降低RNA的Tm值，保持逆轉(zhuǎn)錄酶的活性。GC含量高的序列通過甜菜堿的影響，可使Tm值降低，使6條引物的Tm值接近，使反應(yīng)更加容易進(jìn)行。

L-脯氨酸：可以使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，顯著提高 LAMP 的擴(kuò)增效率。跟甜菜堿一樣，能減少堿基堆積力，刺激反應(yīng)的整體速率，對(duì)目的 DNA 的選擇性顯著增強(qiáng)，降低無關(guān)序列的擴(kuò)增，從而提高結(jié)果的特異性[27]。

其他輔助劑的使用：Fukuta等[28]在RT-LAMP試驗(yàn)中采用了二硫蘇糖醇(DTT)，發(fā)現(xiàn)DTT的巰基可以保護(hù)酶的二硫鍵，進(jìn)而增加酶的穩(wěn)定性。也有研究者用吐溫20或 NP40 來消除核酸提取殘留的 SDS(0.01%及0.10%) 的抑制作用[29]。在環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系中添加7.5%的二甲基亞砜(DMSO) 可增加環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的靈敏度與特異性，抑制引物二聚體的形成，將干擾反應(yīng)降至最低并克服了假陽性擴(kuò)增，此法在靈敏度與特異性方面已優(yōu)于現(xiàn)有的商業(yè)化試劑盒[30]。Lin等[31]在LAMP反應(yīng)體系中通過添加氧化石墨烯(GO)來抑制反應(yīng)體系的非特異性擴(kuò)增，在檢測(cè)環(huán)氧合酶-2(COX2)靶標(biāo)方面顯示出更高的靈敏度和特異性。近年來有報(bào)道顯示聚乙二醇可以加速LAMP 反應(yīng)的進(jìn)行，在LAMP反應(yīng)體系中加入6%的PEG8000可以顯著縮短反應(yīng)時(shí)間[32]。同時(shí)，在反應(yīng)體系中引入 dUTP 進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，并加入有效的尿嘧啶核苷酸酶 (UNG) 降解含有 dUTP 的擴(kuò)增產(chǎn)物，能有效防止氣溶膠污染[33]。

4 LAMP技術(shù)的應(yīng)用

4.1 LAMP技術(shù)在病毒檢測(cè)上的應(yīng)用

Zhao等[34]使用寨卡病毒(ZIKA)的NS5蛋白編碼區(qū)和包膜蛋白(EP)編碼區(qū)作為ZIKA檢測(cè)的目標(biāo)序列。應(yīng)用鈣黃綠素/Mn2+顯色法和實(shí)時(shí)濁度監(jiān)測(cè)兩種不同的技術(shù)來顯示檢測(cè)結(jié)果。該測(cè)定的檢出限為：NS5蛋白編碼區(qū)的DNA為0.5×10-9pmol/μL，EP編碼區(qū)的DNA為1.12×10-11pmol/μL，與實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)相比，其靈敏度提高了100倍。測(cè)試的所有12種非ZIKA病原體的LAMP檢測(cè)均為陰性，表明了該檢測(cè)方法的高特異性。通過RT-LAMP方法靶向西尼羅河病毒(WNV)的Env基因，在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室水浴/干熱浴中于63 ℃孵育60 min來完成基因擴(kuò)增[35]。Zheng等[36]使用LAMP法建立了一種快速而特異的檢測(cè)豬圓環(huán)病毒3型(PCV3)的檢測(cè)方法,與豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)，偽狂犬病病毒(PRV)和豬細(xì)小病毒(PPV)相比，LAMP分析顯示出對(duì)PCV3的高特異性。Hu等[37]通過對(duì)人呼吸道合胞病毒(hRSV)A、B亞型的M和M2-2基因分別設(shè)計(jì)特異性引物，以SYTO-9為熒光染料進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(RT-LAMP)，結(jié)果證實(shí)HRSV-A和HRSV-B之間無交叉反應(yīng)，RT-LAMP和RT-PCR對(duì)臨床樣品的陽性檢測(cè)率分別為67.8%和55.6%，且RT-LAMP的陽性檢出率明顯高于RT-PCR?，F(xiàn)已開發(fā)了多種LAMP技術(shù)用于其他病毒，包括人類免疫缺陷病毒(HIV)等多種對(duì)人類生產(chǎn)與生活具有重要影響的病毒的診斷[38]。

4.2 LAMP技術(shù)在細(xì)菌檢測(cè)上的應(yīng)用

Lin等[39]應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，首次鑒定溶血鏈球菌亞種(SGG)。該方法不會(huì)與其他溶血鏈球菌亞種和大腸桿菌發(fā)生交叉反應(yīng)。應(yīng)用LAMP-磁珠法，通過靶向3a序列來檢測(cè)耶爾森氏菌[40]。相關(guān)結(jié)果表明，LAMP的靈敏度高于PCR，而DNA的磁珠捕獲可以顯著提高LAMP的靈敏度。研究者開發(fā)了一種穩(wěn)定的即用型LAMP測(cè)定法用于檢測(cè)豬場(chǎng)中的產(chǎn)毒霍亂弧菌，該LAMP測(cè)定與常規(guī)PCR方法相比，靈敏度高出100倍，將LAMP反應(yīng)體系加入凍干保護(hù)劑凍干后，到野外直接加入緩沖劑復(fù)性使用，此方法中的LAMP干試劑混合物在室溫下的保質(zhì)期為90.75 d，極大地簡(jiǎn)化了LAMP的操作步驟[41]。

4.3 LAMP技術(shù)在寄生蟲領(lǐng)域的應(yīng)用

Quyen等[42]建立了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲E198A單核苷酸多態(tài)性(SNP)的方法，證實(shí)LAMP成功檢測(cè)到E198A突變，可用于現(xiàn)場(chǎng)樣本中捻轉(zhuǎn)血矛線蟲β-微管蛋白基因E198A單核苷酸多態(tài)性的篩查，為快速檢測(cè)耐苯并咪唑的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的感染，從而預(yù)防和控制感染提供了有用的技術(shù)手段。我國也建立了針對(duì)日本血吸蟲尾蚴鈣結(jié)合蛋白基因的LAMP檢測(cè)[43]和伊氏錐蟲的LAMP檢測(cè)[44]。

4.4 LAMP在其他方面的應(yīng)用

有研究者開發(fā)了同時(shí)快速檢測(cè)腸桿菌科的磺胺耐藥基因sul1，sul2，sul3的多重環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(m-LAMP)的分析方法[45]。Horibe等[46]開發(fā)了一種RT-LAMP，用于檢測(cè)角蛋白19(CK19)mRNA在胃癌中的表達(dá)，作為腫瘤轉(zhuǎn)移的標(biāo)志。為了監(jiān)測(cè)魚翅產(chǎn)品的國際貿(mào)易，保護(hù)瀕臨滅絕的鯊魚物種，But 等[47]對(duì)12種列入瀕危物種國際貿(mào)易公約(CITES)的鯊魚物種建立了快速、方便和靈敏的LAMP檢測(cè)方法。

5 LAMP技術(shù)與其他技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用

5.1 LAMP-微流體技術(shù)

有研究人員通過將特定的LAMP引物組溶解在殼聚糖中，并將引物固定在毛細(xì)管的內(nèi)表面上，同時(shí)組裝數(shù)千個(gè)引物標(biāo)記的毛細(xì)管陣列，制成含多個(gè)微通道的設(shè)備，聯(lián)合LAMP技術(shù)使用一定的傳感設(shè)備定量檢測(cè)或肉眼觀察檢測(cè)結(jié)果，完成了LAMP-微流體技術(shù)的升級(jí)，并命名該技術(shù)為mDC-LAMP，在同一時(shí)間完成1個(gè)至多個(gè)樣本的基因檢測(cè)[48]。Liu等[49]利用磁珠與高通量微流體芯片技術(shù)，開發(fā)了集成環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增分析系統(tǒng)，利用該系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌，臨床樣本陽性檢出率為96.8%。

5.2 LAMP-LFD技術(shù)

Kaewphinit等[50]建立的LAMP-LFD技術(shù),其原理是LAMP反應(yīng)產(chǎn)生的DNA產(chǎn)物已經(jīng)提前經(jīng)過生物素標(biāo)記，LAMP產(chǎn)物同由異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的探針特異性雜交形成復(fù)合物，在LAMP反應(yīng)結(jié)束后，將試紙條放入擴(kuò)增產(chǎn)物的溶液中5～10 min，由于紙相載體有層析作用而使得液相產(chǎn)物擴(kuò)散，試紙條上的檢測(cè)線具有生物素抗性，兩相作用而顯色。LAMP-LFD技術(shù)最低檢測(cè)限可到5 pg的DNA，且改進(jìn)了常規(guī)LAMP技術(shù)的缺陷，靈敏度高、無需昂貴的設(shè)備，經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)約。

5.3 納米金LAMP標(biāo)記技術(shù)

Draz 等[51]應(yīng)用納米金探針對(duì)腸炎沙門菌LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記，然后用萊卡顯微鏡采集拉曼光譜進(jìn)行分析。納米金LAMP標(biāo)記技術(shù)的靈敏度為66 CFU/mL，相較于傳統(tǒng)的PCR法提高了100倍。同時(shí)，特異性得到極大的提高，能區(qū)分非特異性污染。

5.4 微芯片LAMP檢測(cè)技術(shù)

Damhorst等[52]在微芯片和硅微芯片上協(xié)同移動(dòng)智能設(shè)備用HIV微量全血通過RT-LAMP技術(shù)就能檢測(cè)到HIV核酸。Ganguli等[53]通過LAMP微芯片技術(shù)在智能手機(jī)上實(shí)現(xiàn)了寨卡病毒反應(yīng)的實(shí)時(shí)熒光成像，在簡(jiǎn)短的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)疾病的快速診斷和檢測(cè)。隨著智能手機(jī)的大量使用，其強(qiáng)大的數(shù)據(jù)處理能力協(xié)同LAMP技術(shù)和微芯片技術(shù)在開發(fā)移動(dòng)健康工具和監(jiān)視診斷程序方面具有廣闊的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

5.5 LAMP-CRISPR技術(shù)

LAMP技術(shù)與基因編輯技術(shù)的聯(lián)合使用為LAMP技術(shù)帶來了歷史性的革新，基因編輯技術(shù)與LAMP技術(shù)結(jié)合，其檢測(cè)靈敏度達(dá)到了attomolar級(jí)(attomolar =10-3fmol)，能做到識(shí)別單個(gè)堿基差異[54]。同時(shí)，LAMP技術(shù)與基因編輯技術(shù)的聯(lián)合使用，使得該反應(yīng)可在45 min內(nèi)檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因大豆粉中低至0.05%的CaMV35S啟動(dòng)子成分[54]，且無非特異性擴(kuò)增，使得LAMP技術(shù)的特異性和敏感性得到了極大提升。

5.6 其他LAMP技術(shù)的研究

廖翔等[55]建立了使用中性紅pH敏感指示劑檢測(cè)犬細(xì)小病毒的LAMP技術(shù)。Ji等[10]選擇了一種含有酚紅和甲酚紅的顏色指示劑進(jìn)行鴨乙肝病毒產(chǎn)物結(jié)果分析。Jiang等[56]采用結(jié)晶紫染料，通過電化學(xué)儀器來記錄電阻的實(shí)時(shí)變化效率，間接反應(yīng)了LAMP產(chǎn)物的擴(kuò)增。Lee等[57]基于LAMP方法聯(lián)合ELISA和熔解曲線分析法設(shè)計(jì)了 LAMP-TM-ELISA 法對(duì)結(jié)核桿菌的多個(gè)耐藥基因突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，確定多重耐藥結(jié)核桿菌，從而指導(dǎo)臨床用藥。

6 前景與展望

我國已有十幾種LAMP檢測(cè)試劑盒開發(fā)成功并申請(qǐng)了專利[58]。試劑盒的國產(chǎn)化和商業(yè)化可建立起更低廉的檢測(cè)體系，讓LAMP技術(shù)得到進(jìn)一步的推廣和普及，得以在基層實(shí)驗(yàn)室、床邊檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查等領(lǐng)域開展深度運(yùn)用。LAMP 技術(shù)本身具備協(xié)同和兼容其他技術(shù)的特性，可以促使該技術(shù)自身得到不斷的改進(jìn)和提高，讓LAMP技術(shù)更加靈活，對(duì)靶基因序列的檢測(cè)精準(zhǔn)度更高。預(yù)計(jì)LAMP技術(shù)將推廣普及用于細(xì)菌耐藥性相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)，以制定最有效的抗菌藥物治療方案,同時(shí)在生物安全的維護(hù)、海關(guān)檢疫、打擊非法走私生物制品、野生動(dòng)植物非法貿(mào)易等領(lǐng)域提供新的技術(shù)支撐，能適應(yīng)預(yù)報(bào)急性、烈性傳染病和大規(guī)模檢疫的需要，在更多領(lǐng)域得到應(yīng)用。未來將會(huì)出現(xiàn)檢測(cè)材料成本更加低廉化，操作步驟更加簡(jiǎn)便，精確度更高的LAMP技術(shù)，在生物技術(shù)、分子診療等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。