朱道仙，劉莉*,陸江，趙學(xué)剛，郝福星

(1. 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 泰州 225300；2. 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院寵物科技學(xué)院，江蘇 泰州 225300)

硝化應(yīng)激(nitrosative stress)是指在致病因素下，機(jī)體產(chǎn)生的過量高活性含氮分子可以導(dǎo)致細(xì)胞損傷的病理過程[1]。大量研究表明，硝化應(yīng)激可以引起多種疾病，包括內(nèi)皮功能障礙、心血管疾病和神經(jīng)血管疾病等[2-5]。在腦內(nèi)一氧化氮(NO)是一種重要神經(jīng)遞質(zhì)，主要由神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)合成，同時(shí)也是參與硝化應(yīng)激的重要物質(zhì)，與神經(jīng)疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[6]。

犬瘟熱是由犬瘟熱病毒(CDV)引起的犬科動(dòng)物一種常見的病毒性疾病，主要表現(xiàn)為呼吸道癥狀、消化道癥狀、皮膚癥狀和神經(jīng)癥狀等。臨床研究表明，神經(jīng)型犬瘟熱的死亡率較高，治愈率僅為10%左右[7]。尋找對(duì)神經(jīng)型犬瘟熱有早期診斷或預(yù)測(cè)價(jià)值的生物標(biāo)志物以及治療新靶點(diǎn)具有重要意義。以前的研究表明，犬科動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)疾病表現(xiàn)為白色和灰色物質(zhì)的多發(fā)性脫髓鞘損傷，這可能是由于在病毒感染過程中自由基的過度產(chǎn)生和積聚所致[8]。因此，本試驗(yàn)以犬瘟熱臨床病例為對(duì)象，研究硝化應(yīng)激在神經(jīng)型犬瘟熱病理過程中的作用，探討血漿和腦脊液中NO、nNOS和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)水平在神經(jīng)型犬瘟熱臨床病例篩選中的應(yīng)用價(jià)值，為神經(jīng)型犬瘟熱診斷與預(yù)后提供新方法。

1 材料與方法

1.1 病例資料

選取2018年1月到2019年9月期間，到江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院教學(xué)寵物醫(yī)院就診的診斷為犬瘟熱的患犬155例，剔除隨訪失敗或放棄治療以及伴有其他疾病的病例(42例)后，出現(xiàn)以下神經(jīng)癥狀如震顫或癲癇、肌陣攣、共濟(jì)失調(diào)、四肢輕癱或癱瘓等患犬納入神經(jīng)癥狀組(NCD)，共37例，其余76例納入無神經(jīng)癥狀組(NNS)。同時(shí)選取無犬瘟熱健康犬25例作為對(duì)照組(CG)。本試驗(yàn)納入研究犬的基本資料見表1，可以看出，各組犬均以純種犬為主，性別構(gòu)成無顯著差異，年齡分布于5月齡到7月齡，體重2.5～3.5 kg之間，主要以飼喂商品糧為主。

表1 納入研究病例的基本特征

1.2 方法

1.2.1 CDV的診斷標(biāo)準(zhǔn)

采集鼻分泌物后，用CDV抗原膠體金診斷試劑盒(購于韓國安捷動(dòng)物診斷試劑有限公司)對(duì)納入病例進(jìn)行初步診斷。陽性者進(jìn)一步進(jìn)行CDV核酸檢測(cè)(RT-PCR熒光探針法，試劑盒購于上海研生實(shí)業(yè)有限公司)，按說明書進(jìn)行結(jié)果判斷：Ct值≤35.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長為陽性；35.037 或無Ct值為陰性。

1.2.2 血液樣本采集

從橈外側(cè)靜脈無菌采血3 mL，轉(zhuǎn)移到含有EDTA抗凝劑的小瓶中后以3 000 r/min，離心15 min，制備血漿并儲(chǔ)存在-20 ℃下，備用。

1.2.3 腦脊液采集

用846合劑按0.05 mL/kg肌肉注射麻醉犬后，觸摸到枕骨大孔凹陷處，取7號(hào)針頭(針尖磨鈍)，由凹陷順平行犬嘴的方向小心地刺入小腦延髓池。當(dāng)針頭阻力突然消失時(shí)，回抽獲得腦脊液，確定腦脊液量方法為每5 kg體重抽取1 mL。抽取后，需向小腦延髓池注入等量的生理鹽水，以保證腦脊髓腔內(nèi)的壓力。

1.3 硝化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 硝化應(yīng)激指標(biāo)的變化

通過圖1可以發(fā)現(xiàn)，與CG組比較，NNS組血漿和腦脊液中NO水平顯著升高(P<0.05)，NCD組極顯著升高(P<0.01)，且NCD組顯著高于NNS組(P<0.05)。血漿中nNOS水平變化較大，NCD組的水平最高，NNS組次之，CG組最低，各組間差異顯著(P<0.05或P<0.01)。NCD組腦脊液中nNOS水平分別高于NNS組(P<0.05)和CG組(P<0.01)，且均高于各自血漿中水平。犬瘟熱感染后腦脊液和血漿中NSE水平均升高，與CG組比較，NNS組差異顯著(P<0.05)，NCD組差異極顯著(P<0.01)，NCD組與NNS組之間也有顯著差異(P<0.05)。

a.NO；b.nNOS；c.NSE

2.2 硝化應(yīng)激指標(biāo)對(duì)神經(jīng)型犬瘟熱的預(yù)測(cè)分析

根據(jù)不同二分類方式，以靈敏度為縱坐標(biāo)，以1-特異性為橫坐標(biāo)，分別將血漿中和腦脊液中的各指標(biāo)進(jìn)行了ROC曲線分析?？梢钥闯?，以NCD組與CG組作二分類分析時(shí)，NO、nNOS與NSE的ROC曲線AUC均大于0.5，對(duì)神經(jīng)型犬瘟熱具有診斷意義。血漿中nNOS的ROC曲線的AUC最大，靈敏度最高，診斷臨界值為195.4 ng/mL(圖2a)；腦脊液中NSE的預(yù)測(cè)作用最好，診斷臨界值為2.94 ng/mL(圖2c)。以NCD組與NNS組作二分類分析時(shí)，NO、nNOS與NSE的ROC曲線AUC有所降低，血漿中nNOS的AUC最大，診斷臨界值為230.1 ng/mL(圖2b)；腦脊液中NSE最大，診斷臨界值為3.67 ng/mL(圖2d)。

2.3 硝化應(yīng)激指標(biāo)對(duì)神經(jīng)型犬瘟熱的預(yù)后價(jià)值分析

對(duì)NCD組的所有病例進(jìn)行了50 d的隨訪，并以各個(gè)指標(biāo)的平均值為分割點(diǎn)，將NCD組病例分成2個(gè)亞組：低于平均值組(

a、c.NCD組和CG組比較；b、d.NCD組和NNS組比較；a和b為血漿中水平；c和d為腦脊液中水平

a.血漿；b.腦脊液；c.血漿中NSE的生存曲線

3 討論

犬瘟熱是由CDV感染引起的危害犬科、貓科及浣熊科等動(dòng)物一種疾病，病死率高達(dá)80%～90%。近年來，對(duì)于犬瘟熱的診斷取得很大進(jìn)展，免疫膠體金技術(shù)由于使用方便，價(jià)格低廉，已廣泛應(yīng)用于臨床，但存在敏感性和特異性略低的缺點(diǎn)[10]。而RT-PCR技術(shù)在犬瘟熱診斷中具有較高的敏感性和特異性[11]。本研究對(duì)于犬瘟熱的診斷采用了膠體金技術(shù)進(jìn)行初篩，進(jìn)一步用RT-PCR驗(yàn)證，提高了納入病例的準(zhǔn)確性。

研究表明，NO是一種極不穩(wěn)定氣體自由基，可引起硝化應(yīng)激，由NOS催化氧化L-精氨酸合成并釋放，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要由nNOS合成，廣泛分布于哺乳動(dòng)物的各種組織中特別是神經(jīng)組織。NO具有細(xì)胞間第二信使作用的多效應(yīng)分子，其生物學(xué)效應(yīng)具有雙重性，已證實(shí)低濃度NO在大腦神經(jīng)調(diào)節(jié)和神經(jīng)傳遞等方面發(fā)揮重要作用，當(dāng)NO過量時(shí)，則成為神經(jīng)毒物，是腦損傷的關(guān)鍵因子，參與多種炎癥過程，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡，誘導(dǎo)疾病發(fā)生[12]。神經(jīng)癥狀是CDV進(jìn)入中樞神經(jīng)引起脫髓鞘性犬瘟熱腦炎所致，但發(fā)病的分子機(jī)制不詳。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)型犬瘟熱病例的腦脊液與血漿中的NO和nNOS水平均高于非神經(jīng)型犬瘟熱和健康犬，說明硝化應(yīng)激可能是神經(jīng)型犬瘟熱的發(fā)病機(jī)制之一。ROC曲線顯示，不論是腦脊液還是血漿中，NO、nNOS的ROC曲線下面積均大于0.8，對(duì)神經(jīng)型犬瘟熱的診斷具有較高的靈敏度和特異性。

NSE存在于腦脊液和全身循環(huán)中，可作為檢測(cè)神經(jīng)元損傷的標(biāo)志物[13]。在本研究中，NCD組病例血漿中NSE水平高于NNS和CG組，腦脊液中NSE水平甚至是NNS組的2倍，CG組的5倍，這些結(jié)果表明了神經(jīng)損傷是神經(jīng)型犬瘟熱主要的病理機(jī)制。生存曲線分析結(jié)果表明神經(jīng)損傷程度與預(yù)后關(guān)系密切，NSE水平越高，其死亡率越高，治愈率就越低。因此，可以推斷神經(jīng)型犬瘟熱發(fā)生發(fā)展中伴有神經(jīng)損傷過程，可能是由于硝化應(yīng)激造成的，也提示了硝化應(yīng)激可能成為神經(jīng)型犬瘟熱治療的新靶點(diǎn)。

綜上所述，硝化應(yīng)激在神經(jīng)型犬瘟熱發(fā)展過程中具有重要作用，血漿和腦脊液中的NO、nNOS和NSE可作為該病診斷及預(yù)測(cè)的生物標(biāo)志物，而且NSE對(duì)該病具有較高的預(yù)后價(jià)值。