洪素梅，袁月，劉月月，田輝，程藝，張盼濤，王林果，薛景景，劉武杰*，田克恭*

(1. 國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽 471000；2. 普萊柯生物工程股份有限公司，河南 洛陽 471000)

雞新城疫是由新城疫病毒(NDV)引起的一種烈性傳染性疾病，雞群感染后會(huì)產(chǎn)生拉稀、精神沉郁、神經(jīng)紊亂等癥狀[1]，死亡率高，危害嚴(yán)重，目前在全世界范圍內(nèi)流行。雞傳染性支氣管炎是由傳染性支氣管炎病毒(IBV)引起的急性呼吸型傳染性疾病，感染雞常常表現(xiàn)為噴嚏、啰音、呼吸困難等，可造成肉雞增重緩慢、料重比下降，蛋雞產(chǎn)蛋下降、畸形蛋、沙殼蛋增多等[2]，給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。H9亞型禽流感是危害我國養(yǎng)禽業(yè)的重要疾病。雖然H9亞型禽流感病毒(H9 AIV)致病力不高，但病毒易變異[3-4]，雞群感染后往往影響其生長性能和產(chǎn)蛋性能，且易引發(fā)繼發(fā)感染[5-6]，造成重大經(jīng)濟(jì)損失。目前疫苗免疫仍然是預(yù)防這3種傳染病的重要措施。

前期研究中，將免疫原性好、保護(hù)譜廣的H9N2亞型禽流感流行毒株HuN33株的2個(gè)表面基因(HA和NA)與A/PR/8(H1N1)的6個(gè)內(nèi)部基因進(jìn)行重組，構(gòu)建獲得H9亞型禽流感Re-9疫苗株?；谠摱局瓿晒?chuàng)制了雞新城疫、傳染性支氣管炎、禽流感(H9亞型)三聯(lián)滅活苗(La Sota株+M41株+Re-9株)(以下簡稱“三聯(lián)苗(Re-9株)”)。本研究對(duì)三聯(lián)苗(Re-9株)在實(shí)際生產(chǎn)中的有效性進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 疫苗

雞新城疫、傳染性支氣管炎、禽流感(H9亞型)三聯(lián)滅活疫苗(La Sota株+M41株+Re-9株)為普萊柯生物工程有限公司GMP車間制備。雞新城疫、傳染性支氣管炎、禽流感(H9亞型)三聯(lián)滅活疫苗(以下簡稱“對(duì)照苗”)為市場(chǎng)上購買的某公司生產(chǎn)的疫苗。

1.2 抗原

雞NDV的血凝抑制(HI)抗原購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；H9 AIV的HI抗原購自哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司；IBV的HI抗原購自荷蘭GD公司。

1.3 攻毒用毒株

雞NDV北京株毒種購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；H9 AIV A/CK/HuN/33/08株(簡稱HuN33株)由國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心制備、保存。

1.4 試驗(yàn)場(chǎng)所及試驗(yàn)雞

河南省洛陽市周邊某肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)7日齡AA肉雞，1日齡時(shí)進(jìn)行新支二聯(lián)活疫苗噴霧免疫。河南省洛陽市周邊某蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)260日齡海蘭褐蛋雞，2周齡時(shí)免疫新支流法四聯(lián)滅活苗，2月齡時(shí)免疫新支流三聯(lián)滅活苗，開產(chǎn)前(105日齡)免疫新支流減四聯(lián)滅活苗。攻毒試驗(yàn)在普萊柯生物工程股份有限公司禽用負(fù)壓動(dòng)物房進(jìn)行。

1.5 肉雞應(yīng)用效果評(píng)價(jià)

1.5.1 抗體檢測(cè)

10 000羽7日齡AA肉雞頸部皮下免疫三聯(lián)苗(Re-9株)三聯(lián)苗，0.3 mL/羽。同時(shí)設(shè)置100只不免疫空白對(duì)照雞。免疫前從雞群中隨機(jī)抽取30羽采血并分離血清，分別檢測(cè)NDV、IBV和H9 AIV的HI抗體。免疫雞及對(duì)照雞，于免疫后14 d、21 d、出欄當(dāng)天各隨機(jī)抽取30羽，采血并分離血清，分別檢測(cè)上述3種HI抗體。

1.5.2 攻毒保護(hù)試驗(yàn)

免疫后14 d在免疫雞中隨機(jī)抽取20羽，同時(shí)從對(duì)照雞中隨機(jī)抽取10羽，路途保溫帶回實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房。隨機(jī)抽取10只免疫雞及5只對(duì)照雞于負(fù)壓隔離器中分別通過肌肉注射進(jìn)行NDV北京株攻毒保護(hù)試驗(yàn)，攻毒劑量為105.0ELD50/羽，攻毒后連續(xù)觀察14 d，攻毒后第5天采集感染雞泄殖腔拭子，接種10～11日齡雞胚進(jìn)行病毒分離；另10只免疫雞及5只對(duì)照雞通過靜脈注射進(jìn)行H9 AIV HuN33株攻毒保護(hù)試驗(yàn)，攻毒劑量為107.0EID50/羽，攻毒后第5天采集所有雞喉頭及泄殖腔拭子，同只雞的兩種棉拭子混合后作為一個(gè)樣品，接種10～11日齡雞胚進(jìn)行病毒分離。

1.6 蛋雞應(yīng)用效果評(píng)價(jià)

8 000羽260日齡產(chǎn)蛋期海蘭褐蛋雞經(jīng)肌肉注射免疫三聯(lián)苗(Re-9株)，0.5 mL/羽。同時(shí)設(shè)置對(duì)照苗免疫組，0.5 mL/羽免疫200羽。另設(shè)100羽不免疫雞作為空白對(duì)照組。免疫當(dāng)天、免疫后14 d、28 d、2個(gè)月、4個(gè)月、6個(gè)月分別從三聯(lián)苗(Re-9株)和對(duì)照苗免疫雞及對(duì)照雞中隨機(jī)抽取20羽，采血并分離血清，分別檢測(cè)NDV、IBV和H9 AIV HI抗體，研究三聯(lián)苗(Re-9株)免疫效果。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用SPSS軟件中的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法對(duì)2組間抗體檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用ANOVA方法對(duì)3組間抗體檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用Fisher’s exact方法對(duì)攻毒保護(hù)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉雞應(yīng)用效果

2.1.1 抗體檢測(cè)

7日齡AA肉雞于免疫當(dāng)日從雞群中隨機(jī)抽取30羽采血并分離血清，免疫后14、21和35 d從免疫組及對(duì)照組中各隨機(jī)抽取30羽采血并分離血清，分別檢測(cè)NDV、IBV和H9 AIV的HI抗體，結(jié)果詳見表1。整體來看，對(duì)照組抗體值逐漸降低，至出欄當(dāng)日降到最低，三聯(lián)苗(Re-9株)免疫后14 d即可激發(fā)抗體。免疫后21 d，NDV、IBV和H9 AIV的HI抗體均達(dá)到高峰，分別為8.6log2、6.2log2、8.3log2。出欄當(dāng)日(免疫后35 d)，NDV、IBV和H9 AIV的HI抗體分別為8.2log2、5.9log2、7.9log2，均維持在較高水平。三聯(lián)苗(Re-9株)免疫AA肉雞后14、21和28 d的HI抗體水平，均顯著高于不免疫對(duì)照組。

表1 AA肉雞免疫后不同時(shí)間血清HI抗體檢測(cè)結(jié)果 log2

2.1.2 攻毒保護(hù)

免疫后14 d，NDV北京毒株及H9 AIV HuN33株分別通過肌肉注射和靜脈注射攻毒，結(jié)果見表2。新城疫免疫攻毒組均未發(fā)病，排毒比例均為0/10，對(duì)照組發(fā)病比例為3/5，死亡比例為2/5，未死亡雞只全部排毒。禽流感免疫攻毒組排毒比例均為0/10，對(duì)照組排毒比例為4/5。結(jié)果表明，7日齡AA肉雞免疫三聯(lián)苗(Re-9株)免疫后14 d即可產(chǎn)生理想的攻毒保護(hù)結(jié)果。

表2 AA肉雞免疫后14 d NDV和AIV攻毒保護(hù)結(jié)果

2.2 蛋雞應(yīng)用效果

260日齡海蘭褐蛋雞于免疫當(dāng)天及免疫后14 d、28 d、2個(gè)月、4個(gè)月及6個(gè)月，血清中NDV、IBV和H9 AIV的HI抗體效價(jià)結(jié)果詳見表3。不免疫對(duì)照組隨著時(shí)間的增加，3種抗體效價(jià)逐漸下降。三聯(lián)苗(Re-9株)和對(duì)照苗免疫后NDV、IBV和H9 AIV的HI抗體均在14 d明顯上升，28 d達(dá)到高峰，NDV HI抗體分別為12.0log2和11.5log2，IBV HI抗體分別為7.8log2和7.7log2，H9 AIV HI抗體分別為12.2log2和9.7log2，而后逐漸下降。免疫后28 d至6個(gè)月，兩個(gè)免疫組的3種抗體均顯著高于不免疫對(duì)照組，而三聯(lián)苗(Re-9株)免疫組的NDV、IBV的HI抗體效價(jià)與對(duì)照苗免疫組無顯著差異，但H9 AIV HI抗體效價(jià)顯著高于對(duì)照苗免疫組。免疫后6個(gè)月，三聯(lián)苗(Re-9株)免疫組的H9 AIV HI抗體效價(jià)為8.5log2，高于6.5log2的血清學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，也顯著高于對(duì)照苗免疫組(5.2log2)。

3 討論

目前疫苗免疫是防控雞新城疫、傳染性支氣管炎、禽流感的重要措施之一。研究表明，H9 AIV不斷進(jìn)化，易變異[7-9]。本產(chǎn)品前期研究中，選擇來自8個(gè)省份的15株代表性分離株，通過血清交叉試驗(yàn)對(duì)毒株抗原性分析，從中選取6個(gè)毒株進(jìn)行交叉攻毒保護(hù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)HuN33株疫苗對(duì)同源毒株100%保護(hù)，對(duì)異源毒株77%～100%保護(hù)，抗原保護(hù)譜廣[10]。但該毒株雞胚適應(yīng)性差、增殖滴度低，不適合作為疫苗株直接使用。為攻克這一難題，應(yīng)用基因重組技術(shù)將該野生型毒株與雞胚高度適應(yīng)株(PR8株)進(jìn)行重組，構(gòu)建的基因重組毒株(Re-9)保持了野生型親本株良好的免疫原性[11]，且雞胚增殖能力顯著提高，是理想的H9亞型禽流感疫苗株。同時(shí)選擇經(jīng)典新城疫疫苗株La Sota和傳染性支氣管炎疫苗株M41研制出了新支流三聯(lián)滅活苗。

表3 海蘭褐蛋雞免疫后不同時(shí)間血清HI抗體檢測(cè)結(jié)果 log2

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，NDV、IBV和H9 AIV的HI抗體高低與攻毒保護(hù)成正相關(guān)[12-13]。根據(jù)雞場(chǎng)的免疫程序，試驗(yàn)雞前期已經(jīng)免疫過相應(yīng)的弱毒活疫苗或滅活苗，故免疫前體內(nèi)具有一定水平的HI抗體。肉雞僅在1日齡免疫新支二聯(lián)活疫苗時(shí)，至出欄當(dāng)天NDV和H9 AIV的HI抗體僅為3.1log2和3.0log2，存在感染風(fēng)險(xiǎn)；蛋雞對(duì)照組在開產(chǎn)前做最后一次免疫，在新支流(Re-9株)免疫后6個(gè)月NDV和H9 AIV的HI抗體效價(jià)僅為3.5log2和2.9log2，亦存在感染風(fēng)險(xiǎn)。而三聯(lián)苗(Re-9株)免疫AA肉雞和海蘭褐蛋雞后14 d即可產(chǎn)生抗體，肉雞出欄當(dāng)天仍維持在較高水平，且能提供完全的攻毒保護(hù)，故肉雞在免疫活疫苗后需加強(qiáng)免疫相應(yīng)的滅活疫苗或做好生物安全防控，蛋雞需在產(chǎn)蛋高峰期后加強(qiáng)免疫，以保持較高的抗體滴度。由于攻毒時(shí)體內(nèi)仍有部分母源抗體，攻毒對(duì)照組未全部發(fā)病或排毒。國內(nèi)有較多廠家生產(chǎn)新支流三聯(lián)滅活苗，本產(chǎn)品通過與同類產(chǎn)品在蛋雞上的比較發(fā)現(xiàn)，三聯(lián)苗(Re-9株)NDV、IBV的HI抗體部分與對(duì)照苗免疫組相當(dāng)，但三聯(lián)苗(Re-9株)H9 AIV HI抗體從免疫后28 d至6個(gè)月均顯著高于對(duì)照苗免疫組。上述結(jié)果驗(yàn)證了H9 AIV Re-9株作為基因重組毒株在免疫原性上的優(yōu)勢(shì)。新支流三聯(lián)苗(Re-9株)雞群免疫后抗體產(chǎn)生快，免疫持續(xù)期長，可減少蛋雞的免疫次數(shù)，減少應(yīng)激，保障養(yǎng)禽業(yè)健康。