葉思霖，李竺蕓，李寒梅，張祥胤，范尚瑞，李新平，叢日華

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

限制飼料中添加抗生素是一個全球性的問題，每年全球生產(chǎn)的抗生素總量的90%用在了食源動物身上，致使細(xì)菌耐藥性和藥物殘留等問題日益突出。自20世紀(jì)80年代以來，已有多個國家地區(qū)禁止或限制了在飼料中添加抗生素，2006年歐盟全面“飼料禁抗”，2019年7月我國發(fā)布飼料全面“禁抗”令(第194號公告)。當(dāng)前在全球范圍內(nèi)禁用飼用促生長抗生素是共識，無抗或少抗的健康養(yǎng)殖也越來越受到重視[1]。因此，開發(fā)安全、有效的飼用抗生素替代品是目前動物生產(chǎn)領(lǐng)域的重要課題[2]。但目前還沒有找到任何一款替代品能夠完全替代飼料中的抗生素功效且得到公認(rèn)。

益生菌是微生物培養(yǎng)物、培養(yǎng)物提取物、酶制劑或其混合物的統(tǒng)稱，因其能維持和調(diào)整腸道內(nèi)微生物菌群的平衡，提高飼料利用率、生產(chǎn)性能和免疫能力，成為飼用抗生素替代品開發(fā)的重要資源[3-4]。乳酸桿菌(Lactobacillus)可通過產(chǎn)生抗菌物質(zhì)或者通過競爭營養(yǎng)或腸道黏附位點(diǎn)來抑制致病菌，并通過誘導(dǎo)黏附素的分泌或阻止細(xì)胞凋亡而增強(qiáng)腸道的屏障功能[5]。糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)是人和動物腸道內(nèi)主要菌群之一，能產(chǎn)生天然抗生素，有利于機(jī)體健康[6]；同時還能產(chǎn)生細(xì)菌素等抑菌物質(zhì)，抑制大腸桿菌和沙門菌等病原菌的生長，改善腸道微環(huán)境[7]；還能抑制腸道內(nèi)產(chǎn)尿素酶細(xì)菌和腐敗菌的繁殖，減少腸道尿素酶和內(nèi)毒素的含量，使血液中氨和內(nèi)毒素的含量下降[8]。枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是一種好氧性益生菌，能通過消耗掉腸道內(nèi)大量的氧來抑制腸道有害菌并促進(jìn)有益菌的增殖，改善飼料效率和腸道黏膜結(jié)構(gòu)，對防控疾病產(chǎn)生、促進(jìn)動物生長具有積極作用[9]。

張春楊等[10]報道益生菌劑顯著增加了消化道指數(shù)，但具體是哪個消化器官變化沒有統(tǒng)計(jì)說明。研究報道，AA肉雞日糧中單獨(dú)添加乳酸菌、枯草芽孢桿菌和糞腸球菌，與對照組相比均顯著提高42日齡肉雞的免疫器官指數(shù)，但免疫器官的時間發(fā)育變化報道較少[11-13]。

本研究旨在通過在肉雞日糧中添加由乳酸桿菌、糞腸球菌和枯草芽孢桿菌組成的復(fù)合益生菌，按白羽肉雞實(shí)際生產(chǎn)方式養(yǎng)殖，研究該復(fù)合益生菌替代抗生素對處于育雛期(1～21日齡)和育肥期(22～42日齡)白羽肉雞消化器官、免疫器官以及血清生化指標(biāo)的影響，為促進(jìn)益生菌在肉雞無抗養(yǎng)殖的推廣應(yīng)用提供相應(yīng)的理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

60 000羽1日齡白羽肉雛雞，購自陜西質(zhì)誠生物科技有限公司；復(fù)合益生菌(乳酸桿菌、糞腸球菌和枯草芽孢桿菌)均由西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院菌種保藏中心保存，3種菌以乳酸桿菌∶糞腸球菌∶枯草芽孢桿菌 =5∶2∶3的比例按著特定的工藝流程制作，活菌數(shù) ≥1.0×109CFU/g；抗生素，市售七日開口素。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

將體重均勻、健康狀況基本相同的60 000羽1日齡白羽肉雛雞隨機(jī)分為3組，每組8個重復(fù)，每重復(fù)2 500羽，對照組飼喂基礎(chǔ)日糧添加抗生素，試驗(yàn)組以濕拌料的方式分別飼喂基礎(chǔ)日糧添加1‰(低劑量組)、1.5‰(高劑量組)的復(fù)合益生菌。試驗(yàn)在陜西質(zhì)誠生物科技有限公司臨潼養(yǎng)殖場展開，飼養(yǎng)管理參照白羽肉雞的飼養(yǎng)管理手冊進(jìn)行，按管理要求嚴(yán)格控制光照、溫度和濕度，保持良好的通風(fēng)，定期消毒和打掃雞舍，并按免疫程序?qū)θ怆r雞進(jìn)行免疫，保證飼料充足，自由采食、飲水。試驗(yàn)期42 d。

1.3 試驗(yàn)日糧

基礎(chǔ)日糧配方參考美國NRC(1994)肉雞的營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)并結(jié)合陜西省當(dāng)?shù)匕子鹑怆u的生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)配制，具體配方如表1所示。

1.4 樣品采集及指標(biāo)測定

1.4.1 血液生化指標(biāo)的測定

分別于21 d、42 d從每重復(fù)中隨機(jī)取1羽肉雞，即每次每組各取8羽肉雞，進(jìn)行活體稱重，頸靜脈采集血液2管，置于4 ℃低溫保存運(yùn)輸，其中1管血液樣品通過離心(3 500 r/min，10 min)制成血清，置于-80 ℃保存，隨后送至陜西省楊凌示范區(qū)醫(yī)院進(jìn)行血清生化檢測；另一管血液樣品保存在4 ℃冰箱，于次日送至西北農(nóng)林科技大學(xué)校醫(yī)院進(jìn)行血常規(guī)檢測，結(jié)束后將其制成血漿，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 消化器官、免疫器官指數(shù)計(jì)算

將1.4.1中隨機(jī)選取的肉雞，頸靜脈放血處死，立即解剖并分離消化器官(肝臟、肌胃、腺胃、腸道)和免疫器官(脾臟和盲腸)，其中腸道以十二指腸、空腸、回腸和盲腸腸段分別進(jìn)行稱重，稱重前用生理鹽水洗去內(nèi)容物，計(jì)算消化器官、免疫器官指數(shù)。

器官指數(shù)(g/kg)=器官重量(g)/體重(kg)。

表1 基礎(chǔ)日糧配方組成及營養(yǎng)水平

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用軟件SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan’s 法進(jìn)行探索性分析和One-way ANOVA進(jìn)行方差分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合益生菌對肉雞消化器官生長的影響

試驗(yàn)雞消化器官外觀均未見異常，具體生長變化見表2。

表2 復(fù)合益生菌對肉雞體重、消化器官重量及其指數(shù)的影響(n=8)

21 d時，與對照組相比，高劑量組肌胃指數(shù)極顯著降低(P<0.01)，高劑量組空腸指數(shù)顯著增加(P<0.05)。42 d時，與對照組相比，低劑量組、高劑量組肝臟重及其指數(shù)、十二指腸重及其指數(shù)、空腸重及其指數(shù)和總腸道重及其指數(shù)表現(xiàn)均為極顯著增加(P<0.01)；低劑量組回腸重顯著增加(P<0.05)，而高劑量組回腸重及其指數(shù)均極顯著升高(P<0.01)。

2.2 復(fù)合益生菌對肉雞免疫器官生長的影響

試驗(yàn)雞免疫器官外觀均未見異常，具體生長變化見表3。21 d時，與對照組相比，低劑量組脾臟重及脾臟指數(shù)均極顯著低于對照組(P<0.01)，高劑量組脾臟重顯著低于對照組(P<0.05)。42 d時，與對照組相比，低劑量組盲腸重及其指數(shù)均極顯著高于對照組(P<0.01)。

表3 復(fù)合益生菌對肉雞免疫器官重量及其指數(shù)的影響

2.3 復(fù)合益生菌對肉雞血常規(guī)的影響

肉雞血常規(guī)的變化見表4。21 d時，與對照組相比，高劑量組嗜堿性粒細(xì)胞比率和紅細(xì)胞總數(shù)均顯著降低(P<0.05)，但高劑量組平均紅細(xì)胞體積極顯著增加(P<0.01)。42 d時，與對照組相比，低劑量組紅細(xì)胞總數(shù)、血紅蛋白含量和血細(xì)胞比容均顯著降低(P<0.05)。

表4 復(fù)合益生菌對肉雞血常規(guī)的影響

續(xù)表4

2.4 復(fù)合益生菌對肉雞血漿生化指標(biāo)的影響

肉雞血漿生化指標(biāo)的變化見表5。21 d時，與對照組相比，低劑量組谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)顯著增加(P<0.05)，高劑量組極顯著增加(P<0.01)；低劑量組血尿素氮(BUN)顯著降低(P<0.05)；高劑量組甘油三酯(TG)顯著增加(P<0.05)。42 d時，與對照組相比，低劑量組谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)顯著降低(P<0.05)；低劑量組膽堿酯酶(CHE)顯著降低(P<0.05)；高劑量組血糖(GLU)顯著增加(P<0.05)；高劑量組TG極顯著增加(P<0.01)；低劑量組低密度脂蛋白(LDL-C)含量顯著降低(P<0.05)；高密度脂蛋白(HDL-C)含量無顯著變化(P>0.05)。

表5 復(fù)合益生菌對肉雞血漿生化指標(biāo)的影響

3 討論

3.1 復(fù)合益生菌對肉雞體重、消化器官的影響

在動物試驗(yàn)中，畜禽體重是衡量試驗(yàn)變量有效與否最直接的證據(jù)之一。李宗凱等[14]報道益生菌顯著提高了育肥豬生長期平均日增重。Hossain等[15]研究表明，在基礎(chǔ)日糧中添加益生菌，肉雞體重顯著增加。但也有Bai等[16]研究表明益生菌對育肥后期肉雞體重?zé)o顯著影響。本研究表明，日糧中添加該復(fù)合益生菌，對肉雞育雛期和育肥期的體重均無顯著影響。

通常認(rèn)為以消化器官重量及其指數(shù)來衡量肉雞的消化吸收功能是最直觀的。張春楊等[10]研究表明益生菌劑顯著增加了消化道指數(shù)。本試驗(yàn)顯示，復(fù)合益生菌能極顯著增加42日齡肉雞肝臟、十二指腸、空腸和總腸道重量及其指數(shù)，說明使用該復(fù)合益生菌可以促進(jìn)消化器官生長，從而增強(qiáng)肉雞消化吸收。此外，高劑量組肌胃生長在21日齡受到了極顯著抑制，但這種抑制狀況在育肥期消失，這可能與育雛期肉雞機(jī)體還處于適應(yīng)高劑量復(fù)合益生菌定植中有關(guān)，其原因有待進(jìn)一步研究。

3.2 復(fù)合益生菌對肉雞免疫器官的影響

飼養(yǎng)過程中，肉雞的健康是重中之重，因此肉雞免疫抗病能力是肉雞養(yǎng)殖業(yè)關(guān)注的焦點(diǎn)問題。免疫器官的生長發(fā)育是判斷肉雞免疫力強(qiáng)弱的重要依據(jù)，其重量和器官指數(shù)變化能一定程度上反應(yīng)機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱以及其淋巴細(xì)胞增殖的程度，可粗略估計(jì)免疫功能的強(qiáng)弱[17]。脾臟是肉雞體內(nèi)最大的外周免疫器官，參與全身的細(xì)胞免疫和體液免疫，而盲腸內(nèi)含有大量淋巴組織，可以幫助刺激腸道中良好細(xì)菌的生長，對機(jī)體免疫起正面作用，兩者都與肉雞機(jī)體免疫功能密切相關(guān)。李龍等[18]研究結(jié)果表明益生菌顯著提高了育肥期肉雞的脾臟指數(shù)，而謝文恵等[19]研究表明益生菌對育雛期和育肥期肉雞脾臟的生長沒有顯著影響。本研究表明，復(fù)合益生菌對21日齡肉雞脾臟的生長產(chǎn)生了抑制作用，且低劑量組肉雞脾臟受抑制更明顯，但到了42日齡，這種抑制作用消失，3個組之間無顯著差異。出現(xiàn)脾臟生長先受到抑制后抑制解除這一現(xiàn)象，可能是育雛期肉雞還在適應(yīng)復(fù)合益生菌的定植，其原因還需進(jìn)一步研究。

3.3 復(fù)合益生菌對肉雞血常規(guī)的影響

血常規(guī)檢驗(yàn)的是血液的細(xì)胞部分。通過觀察血細(xì)胞數(shù)量變化及形態(tài)分布，可以更好地了解畜禽身體狀況并進(jìn)行疾病的早期檢測與預(yù)防。Cetin等[20]研究顯示血細(xì)胞數(shù)目、血紅蛋白含量在高劑量組顯著增高，而在Alkhalf等[21]研究中則顯示其他2個試驗(yàn)組與對照組無顯著差異。本研究表明，復(fù)合益生菌顯著降低21日齡嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)目，但對42日齡的作用不明顯。對紅細(xì)胞比容在21日齡作用不明顯，這與Alkhalf等[21]的研究一致，而在42日齡高劑量組顯著降低，這說明紅細(xì)胞在全血中所占的容積百分比偏低。綜合總血紅蛋白含量及血細(xì)胞數(shù)目偏低(降低幅度均在10%左右)，說明該復(fù)合益生菌可能產(chǎn)生紅細(xì)胞下降趨勢。目前對飼料添加益生菌改變血細(xì)胞的研究較少，其原因還需進(jìn)一步研究。

3.4 復(fù)合益生菌對肉雞血漿生化指標(biāo)的影響

血漿生化指標(biāo)是檢測血漿中特定物質(zhì)含量的一種手段。這些特定物質(zhì)含量的變化往往能反映機(jī)體的生長狀態(tài)，對畜禽的飼養(yǎng)管理具有重大意義。

AST和ALT活性變化是判斷機(jī)體肝細(xì)胞是否受損的最特異性指標(biāo)[22]。肝細(xì)胞受損、細(xì)胞膜通透性增加，AST和ALT就會從肝細(xì)胞胞漿中釋放出來。Sharma等[23]研究表明益生菌顯著增加了消化道指數(shù)。研究表明，益生菌對某些肝臟疾病(如脂肪肝)有一定療效。郝雅蓉等[24]研究表明，使用益生菌能緩解細(xì)菌脂多糖導(dǎo)致的ALT升高。本研究結(jié)果表明，在21日齡時高低劑量組血液中ALT均顯著增加，且高劑量組比低劑量組增加更顯著，與已有研究相反。但是在42日齡高低劑量組和對照組血液中ALT沒有顯著差異，低劑量組AST降低，與已有研究相符。該結(jié)果表明使用該復(fù)合益生菌替代抗生素可能導(dǎo)致育雛期一定程度的肝損傷，但在育肥期該差異已經(jīng)消除，這可能與肉雞早期發(fā)育不全，適應(yīng)復(fù)合益生菌的定植有關(guān)，其原因還需進(jìn)一步研究。

CHE也是主要由肝臟合成釋放的，當(dāng)肝臟損傷時CHE的合成減少，所以肝臟損傷的嚴(yán)重程度和血清CHE的含量成反比[25]。42日齡時，低劑量組CHE顯著低于對照組，高劑量組有降低趨勢但差異不顯著。結(jié)合ALT變化說明該復(fù)合益生菌組替代抗生素可能導(dǎo)致一定程度的肝損傷，其原因還需進(jìn)一步研究。

BUN通常是作為反映機(jī)體蛋白質(zhì)和氨基酸代謝水平的指標(biāo)，其含量下降表明機(jī)體蛋白質(zhì)合成增加，氮素利用提高和尿素合成的降低[26]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，21日齡低劑量組BUN顯著降低，這與唐志剛等[27]的研究相符，說明該復(fù)合益生菌對蛋白質(zhì)合成有促進(jìn)作用。

TG是反映機(jī)體脂肪代謝水平的重要指標(biāo)，與脂類代謝水平成正比。本試驗(yàn)結(jié)果表明，高劑量組TG含量在21日齡時顯著增加，而42日齡TG極顯著增加，這與唐志剛等[27]的研究相反。這說明該復(fù)合益生菌對脂類物質(zhì)代謝有促進(jìn)作用，其作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究中日糧添加不同濃度的復(fù)合益生菌可以促進(jìn)白羽肉雞消化器官，特別是肝臟、十二指腸、空腸的生長，促進(jìn)脂類合成以及蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝，但對21日齡肉雞脾臟具有抑制作用。與抗生素組相比體重變化差異不大，說明可以部分或全部替代促生長抗生素進(jìn)而促進(jìn)肉雞生長發(fā)育。