秦仁炳，王書(shū)軍，項(xiàng)豐娟，王津，王碩*

（1.天津科技大學(xué)食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；3.南開(kāi)大學(xué)醫(yī)學(xué)院天津市食品科學(xué)與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300071）

淀粉和脂類(lèi)是食品的宏量營(yíng)養(yǎng)元素，對(duì)食品的風(fēng)味、質(zhì)地和營(yíng)養(yǎng)起著重要作用。淀粉和脂質(zhì)在加工過(guò)程中可形成淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物[1]。淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物具有較強(qiáng)的抗淀粉水解酶能力[2-4]，因此最新研究把淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物列為一種新型抗性淀粉（resistant starch，RS），即RS5[5-6]?？剐缘矸劭梢员荒c道菌群發(fā)酵產(chǎn)生多種有益代謝產(chǎn)物如：短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）和乳酸等[7-9]，降低腸道 pH 值，促進(jìn)有益菌生長(zhǎng)，減少有害菌的滋生，在調(diào)節(jié)腸道平衡和改善機(jī)體健康方面發(fā)揮重要作用[10-12]。由于抗性淀粉對(duì)人體健康有諸多益處，因此提高食物中的RS含量是近年來(lái)食品科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。前期的研究主要集中在熱加工方法制備RS的條件優(yōu)化或加工對(duì)RS的結(jié)構(gòu)和消化性影響等[13-16]。但是熱加工處理往往會(huì)誘導(dǎo)食品中熱不穩(wěn)定物質(zhì)發(fā)生若干化學(xué)和物理變化，從而破壞食品的顏色、風(fēng)味、口味、質(zhì)地，降低某些有效成分的含量及生物可利用性[17]，因此在高級(jí)食品加工方面受到一定限制。與熱加工技術(shù)相比，非熱加工技術(shù)相對(duì)溫和，可以最大限度地降低食品加工過(guò)程中由熱引起的不利變化[18]。近年來(lái)，隨著消費(fèi)者對(duì)高品質(zhì)食品的訴求越來(lái)越高，非熱加工技術(shù)逐漸成為食品加工技術(shù)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。而關(guān)于食品的非熱加工在食品中淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物的形成、性質(zhì)以及對(duì)食品的質(zhì)地和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的影響報(bào)道很少[19-23]。在眾多的非熱加工技術(shù)中，由于超高壓是目前一種研究最廣泛，商業(yè)化程度最高的非熱加工技術(shù)方法，可瞬時(shí)、均勻地作用于樣品。超高壓只對(duì)較弱的非共價(jià)鍵造成一定程度的破壞，因而，一些熱不穩(wěn)定物質(zhì)不會(huì)受到超高壓處理的影響，故對(duì)食品天然的感官品質(zhì)影響很小[24]。因此超高壓在食品加工技術(shù)領(lǐng)域越來(lái)越受到人們關(guān)注。

淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物作為一種重要的抗性淀粉形式（RS5），與其它類(lèi)型抗性淀粉相比，具有自己獨(dú)特結(jié)構(gòu)和功能，可在實(shí)驗(yàn)室可控條件下制備，為研究超高壓對(duì)RS5的結(jié)構(gòu)和功能變化提供了一個(gè)良好的模型系統(tǒng)。因此，本研究的目的是探討不同壓力處理對(duì)RS5結(jié)構(gòu)和體外酶消化性影響。研究結(jié)果對(duì)進(jìn)一步了解食品非熱加工處理過(guò)程中RS5的結(jié)構(gòu)和功能變化，更好地控制食品加工過(guò)程中淀粉的消化具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

高直鏈玉米淀粉VII（HA7，直鏈淀粉含量為68.70%）：宜瑞安（Westchester，IL，USA）公司；普魯蘭酶（1498NPUN/mL）、月桂酸（C12：0，LA）、α-淀粉酶（13 U/mg）：美國(guó) Sigma公司；GOPOD 試劑盒、淀粉轉(zhuǎn)葡糖苷酶（3260單位/mL）：愛(ài)爾蘭Megazyme國(guó)際公司。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HVE-50高壓滅菌鍋：日本hirayama公司；HPP.L2-600/0.6超高壓儀：華泰森淼生物工程技術(shù)股份有限公司；DSC200 F3差示掃描量熱儀：德國(guó)NETZCH公司；UV-180紫外分光光度計(jì)：日本Shimadzu（島津）公司；D8Advance廣角X射線(xiàn)衍射儀：德國(guó)布魯克公司；inVia Reflex激光共聚焦拉曼光譜儀：英國(guó)雷尼紹公司；SHJ-A磁力攪拌水浴鍋：上海璽袁科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物制備

淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物的制備方法是參考QIN等[16]的方法。用0.2 mol/L醋酸鈉緩沖液（pH 5.0）把HA7配成10%淀粉懸浮液然后于高壓鍋中130℃下加熱60 min，使HA7充分凝膠化。將凝膠化的淀粉糊冷卻至60℃，加入普魯蘭酶（80 NPUN/g淀粉）攪拌12 h使其充分脫支。將脫分支之后的淀粉懸浮液于130℃下再一次加熱30 min，然后加入月桂酸，其添加量為淀粉干基10%，在90℃水浴鍋中攪拌復(fù)合1 h，將復(fù)合物攪拌冷卻至25℃。淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物懸浮液2 000 g離心20 min，用50%乙醇洗滌3次。制備得到淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物命名為DHA7-LA，冷凍干燥，研磨過(guò)100 μm篩，放在密閉容器中于4℃條件下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物超高壓處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取2 g DHA7-LA放入聚丙烯袋中加6 mL蒸餾水使DHA7-LA與蒸餾水充分混合。然后用真空封口機(jī)密封，放在25℃下平衡2 h后將樣品放入超高壓設(shè)備中，分別在200、300、400、500 MPa的壓力條件下25℃處理10 min。處理后樣品立即用液氮速凍（命名為 200-LA、300-LA、400-LA 和 500-LA），隨后在真空冷凍干燥機(jī)里冷凍干燥，并研磨后過(guò)100 μm篩于4℃條件下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 差示掃描量熱法（differential scanning calorimetry，DSC）

利用差示掃描量熱儀和熱分析數(shù)據(jù)站對(duì)樣品的熱性能進(jìn)行測(cè)量。準(zhǔn)確稱(chēng)取復(fù)合物樣品3 mg放入鋁盤(pán)坩堝中，向鋁盤(pán)坩堝內(nèi)添加去離子水使水∶復(fù)合物的質(zhì)量比例達(dá)到3∶1。在DSC測(cè)量之前，將制備好的樣品于25℃下平衡過(guò)夜，然后樣品以10℃/min的升溫速率從20℃加熱至135℃。用空DSC鋁盤(pán)坩堝作為空白參比，用儀器自帶的熱分析軟件分析復(fù)合物的熱轉(zhuǎn)變溫度（起始凝膠化溫度To，峰值溫度Tp，終止溫度Tc）和凝膠化焓值變化（ΔH）。每個(gè)樣品至少重復(fù)3次[25]。

1.3.4 激光共聚焦顯微拉曼光譜

首先硅片校正儀器，然后將少量樣品用載玻片壓至緊實(shí)平整，在顯微鏡視野中選擇清晰界面進(jìn)行測(cè)試，激光光源為波長(zhǎng)785 nm。具體測(cè)試參數(shù)：掃描范圍為 100 cm-1～3 200 cm-1，激光功率為 50%，分辨率為7 cm-1，每個(gè)樣品至少采集6個(gè)不同的點(diǎn)，使用儀器自帶軟件WIRE 2.0處理樣品圖譜，并記錄半峰寬（full width at half-maximum，F(xiàn)WHM）數(shù)據(jù)[3]。

1.3.5 廣角X-射線(xiàn)衍射（X-ray diffraction，XRD）

復(fù)合物的相對(duì)結(jié)晶度是由X-射線(xiàn)衍射儀在40 kV和40 mA Cu-Kα輻射（λ=0.154 06 nm）條件下進(jìn)行檢測(cè)得到。首先樣品在含有飽和NaCl溶液的密閉容器中于25℃下平衡7 d后進(jìn)行分析。X-射線(xiàn)衍射光譜的掃描范圍從 4°～35°（2θ），掃描速率為 2°/min，步長(zhǎng)0.02°。用TOPAS 5.0軟件計(jì)算樣品的相對(duì)結(jié)晶度。

1.3.6 淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物的體外酶消化測(cè)定

參考Wang等[26]的淀粉體外消化方法對(duì)樣品進(jìn)行了消化分析。具體操作方法如下：準(zhǔn)確稱(chēng)取樣品（100mg，干基）放入4.0 mL含有0.1 mmol/L乙酸鈉緩沖液（pH 5.2）中，然后加入1.0 mL新制備的含有1 645個(gè)單位的α-淀粉酶和41個(gè)單位的淀粉轉(zhuǎn)葡萄糖苷酶消化酶液，復(fù)合物/酶混合物放置于37℃磁力攪拌水浴鍋中260 r/min孵育2 h。每隔20 min取0.05 mL的水解產(chǎn)物，加入0.95 mL的95%乙醇混合，使消化酶失活，然后在13 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心3 min。采用GOPOD試劑盒測(cè)定葡萄糖釋放量。水解指數(shù)（HI）用超高壓前后樣品的水解曲線(xiàn)下面積（0～120 min）與同一時(shí)期白面包對(duì)應(yīng)面積比值的百分比表示。然后采用Granfeldt等[27]提出的經(jīng)驗(yàn)計(jì)算公式估算復(fù)合物的血糖指數(shù)（eGI）值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有的分析都至少做了3個(gè)平行處理。數(shù)據(jù)結(jié)果的表示方法為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，對(duì)于XRD只做1次，采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析然后用 post-hoc Duncan’s多重比較分析（p＜0.05）測(cè)定平均值之間的顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 超高壓處理前后淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物長(zhǎng)程有序性分析

超高壓處理前后的DHA7-LA的XRD衍射圖譜和結(jié)晶度見(jiàn)圖1和表1所示。

圖1 淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物經(jīng)超高壓處理前后的X-射線(xiàn)衍射圖譜Fig.1 XRD patterns of starch-lipid complexes before and after HPP-treated

表1 拉曼和XRD檢測(cè)的淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)特征Table 1 Structural characteristics of starch-lipid complexes determined by LCM-Raman and XRD

從圖1可以看出，DHA7-LA樣品在2θ為5.6°、7.5°、12.9°、16.9°、19.8°、22.6°具有明顯 XRD 衍射峰。DHA7和LA形成的復(fù)合物為典型V型晶體結(jié)構(gòu)在7.5°、12.9°、19.8°（2θ）處具有明顯 XRD 衍射峰，而5.6°、16.9°、22.6°（2θ） 處的 XRD 衍射峰表明存在淀粉回生的B型淀粉晶體結(jié)構(gòu)。

上述結(jié)果表明，所制備的復(fù)合物由B型和V型兩種晶體類(lèi)型組成。從圖1可以看出超高壓處理沒(méi)有改變X-射線(xiàn)衍射類(lèi)型，但是隨著壓力的逐漸增大，DHA7-LA的XRD衍射峰強(qiáng)度逐漸降低，結(jié)晶度從（33.8±0.5）%（DHA7-LA） 逐漸降低到（22.9±0.5）%（500-LA），衍射峰寬度逐漸增大，說(shuō)明超高壓處理能破壞其淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物完美的晶體結(jié)構(gòu)（圖1和表1）。主要因?yàn)槌邏禾幚碛绊憦?fù)合物的單螺旋結(jié)晶結(jié)構(gòu)，使水分子進(jìn)入淀粉顆粒內(nèi)部，使淀粉結(jié)晶區(qū)的螺旋結(jié)構(gòu)打開(kāi)，導(dǎo)致結(jié)晶度降低[28]。

2.2 超高壓處理前后復(fù)合物短程有序性分析

拉曼圖譜是表征淀粉-復(fù)合物短程有序性的重要手段，拉曼光譜中位于 480、865、940、1 264 cm-1的譜帶是與淀粉相關(guān)的典型譜帶，這些峰分別與淀粉的吡喃環(huán)的骨架振動(dòng)、CH2振動(dòng)、C-O-C的骨架振動(dòng)和CH2OH（側(cè)鏈）振動(dòng)有關(guān)[29-31]。淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物經(jīng)超高壓處理后的拉曼圖譜見(jiàn)圖2。

由圖 2 可知，DHA7-LA 在 480、865、940、1 264 cm-1處有明顯峰出現(xiàn)。拉曼圖譜的480 cm-1處的半峰寬對(duì)淀粉短程有序性（即螺旋簇的排列）的變化敏感，F(xiàn)WHM值越小，表明淀粉短程分子有序結(jié)構(gòu)越高[32-33]。由圖2和表1可以看出，淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物經(jīng)超高壓處理后半峰寬呈現(xiàn)變寬趨勢(shì)并且480 cm-1強(qiáng)度也在逐漸減弱，其中 480 cm-1半峰寬從（14.18±0.43）cm-1增加到（14.85±0.24）cm-1。說(shuō)明超高壓破壞了淀粉的短程有序結(jié)構(gòu)且隨著壓力的增加破壞程度逐漸增大，與前面的XRD結(jié)果相一致。

圖2 淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物經(jīng)超高壓處理后的拉曼圖譜Fig.2 Raman spectra of starch-lipid complexes before and after HPP-treated

2.3 淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物熱力學(xué)性質(zhì)分析

超高壓處理前后淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物的DSC熱分析圖和相應(yīng)的熱轉(zhuǎn)變溫度（To、Tp和 Tc）及焓變化（ΔH）如表2所示。

DHA7-LA復(fù)合物有兩個(gè)吸熱轉(zhuǎn)變溫度，Tp1和Tp2分別為I型復(fù)合物和II型復(fù)合物的峰值溫度，分別為（95.5±0.3）℃和（113.4±0.3）℃。超高壓處理后Tp1和Tp2峰呈現(xiàn)增加的變化趨勢(shì)，而總ΔH呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，表明超高壓能夠顯著影響復(fù)合物組成和含量，從表2可以看出處理壓力為200 MPa就能使II型的淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物向I型復(fù)合物轉(zhuǎn)變，到300 MPa時(shí)II型復(fù)合物焓值顯著減少?gòu)模?.2±0.1）J/g降低到（2.6±0.8）J/g，I型復(fù)合物焓值由（0.6±0.1）J/g增加到（5.1±0.8）J/g，但是200 MPa～300 MPa處理時(shí)復(fù)合物總焓值并沒(méi)有減少，說(shuō)明復(fù)合物類(lèi)型遭到改變，但是復(fù)合物總量并沒(méi)有減少，隨著壓力進(jìn)一步升高復(fù)合物總焓值逐漸降低，其中在400 MPa處理后復(fù)合物總焓值為5.6 J/g，在500 MPa未檢測(cè)到II型復(fù)合物熔融峰，復(fù)合物總量也最低為（3.4±0.6）J/g，表明超高壓能有效破壞淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)且隨著壓力的升高破壞能力逐漸增強(qiáng)。隨壓力升高，I型復(fù)合物和II型復(fù)合物相轉(zhuǎn)變溫度逐漸升高，其中凝膠化峰值溫度Tp1由（95.5±0.3）℃升高到（97.9±0.5）℃，Tp2由（113.4±0.3）℃升高到（120.2±0.4）℃。另外凝膠化起始溫度和凝膠化終止溫度也都有一定提高。凝膠化轉(zhuǎn)變溫度升高可能是：（1）由于超高壓處理后DHA7-LA樣品中較不穩(wěn)定的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)熔融，留下更穩(wěn)定的殘余晶體，從而導(dǎo)致更高的熔融溫度[34-35]；（2）超高壓處理壓力或退火過(guò)程中能使一部分IIa型復(fù)合物向結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，熔融溫度更高的IIb型晶體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變；（3）超高壓作用下，淀粉晶體結(jié)構(gòu)的破壞導(dǎo)致無(wú)定形區(qū)域的增加可能阻礙了水的吸收和淀粉溶脹，從而減緩了淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物粉晶體的熔融[36]。

表2 超高壓處理前后淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物的熱力學(xué)參數(shù)表Table 2 Thermal properties of starch-lipid complexes before and after HPP-treated

2.4 淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物樣品的體外消化性

淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物樣品的體外酶消化圖譜如圖3所示。所有樣品均表現(xiàn)出初始階段消化速度快，約60 min后消化速度就趨于平穩(wěn)。對(duì)超高壓處理前后淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物的快消化淀粉、慢消化淀粉、抗性淀粉和評(píng)估血糖指數(shù)進(jìn)行計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表3。

圖3 淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物經(jīng)超高壓處理前后的體外消化圖譜Fig.3 In vitro starch digestograms of starch-lipid complexes before and after HPP-treated

表3 超高壓處理前后淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物體外消化性和評(píng)估血糖指數(shù)Table 3 In vitro digestibility and estimated glycemic index of starch-lipid complexes before and after HPP-treated

從表3可以看出DHA7-LA復(fù)合物的最終消化率為 54.0%，評(píng)估血糖值數(shù)（eGI）為 56.4±0.6，淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物為中eGI食物[37]。超高壓提高DHA7-LA的消化性，主要因?yàn)槌邏禾幚碛绊懥薉HA7-LA復(fù)合物的結(jié)晶結(jié)構(gòu)類(lèi)型，破壞復(fù)合物的長(zhǎng)程-短程有序性，導(dǎo)致DHA7-LA復(fù)合物結(jié)構(gòu)變得疏松，更易于與淀粉酶接觸發(fā)生水解，另外淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物含量降低，所以RDS含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，RS含量呈下降趨勢(shì)。

3 結(jié)論

本文研究了一種重要的非熱加工方式——超高壓對(duì)DHA7-LA處理后結(jié)構(gòu)和體外消化性的影響。研究結(jié)果顯示，DHA7-LA為V型晶體和B型晶體混合物，超高壓處理后的DHA7-LA晶體類(lèi)型未發(fā)生明顯變化，但是結(jié)晶度顯著減少，XRD衍射峰明顯變寬完美晶體結(jié)構(gòu)遭到破壞，短程分子有序性變差，復(fù)合物類(lèi)型由II型轉(zhuǎn)變成I型直至消失。同時(shí)超高壓處理后RDS升高，RS含量下降，eGI升高。結(jié)果表明超高壓處理能對(duì)新型抗性淀粉（RS5）結(jié)構(gòu)和體外消化性造成顯著影響，研究結(jié)果對(duì)于深入理解抗性淀粉在超高壓加工過(guò)程中的變化具有重要的理論和實(shí)踐意義。