黎玉翠 陽進(jìn)績(jī) 鄧宗虎 張業(yè)懷 李鳳梅

廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)系，南寧530007

養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)場(chǎng)是學(xué)院畜牧獸醫(yī)專業(yè)及動(dòng)物醫(yī)學(xué)專業(yè)學(xué)生開展實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)教學(xué)的重要場(chǎng)所，也是完成職業(yè)技能培訓(xùn)、鑒定的重要基地。近年來，學(xué)院為了提高辦學(xué)水平，加大了試驗(yàn)經(jīng)費(fèi)投入，養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)場(chǎng)條件獲得了很大的改善，特別是試驗(yàn)動(dòng)物的種類和數(shù)量與之前比增加許多。試驗(yàn)動(dòng)物主要有豬、牛、羊、犬、家禽及家兔等畜禽，主要用于動(dòng)物解剖學(xué)、生理學(xué)、外科手術(shù)學(xué)、病理學(xué)、藥理學(xué)及動(dòng)物微生物學(xué)與免疫學(xué)、動(dòng)物診療等多門課程試驗(yàn)或?qū)嵱?xùn)教學(xué)，為學(xué)生開展專業(yè)技能操作訓(xùn)練、科研創(chuàng)新提供支撐作用也日益明顯。

實(shí)訓(xùn)場(chǎng)的動(dòng)物往往是以最低價(jià)位中標(biāo)的方式進(jìn)行采購(gòu)，有的中標(biāo)單位為了降低購(gòu)買成本會(huì)從無資質(zhì)單位或農(nóng)村散戶、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)等地購(gòu)買試驗(yàn)動(dòng)物。農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)由于人流量大、動(dòng)物種類多而更具有感染、傳播的風(fēng)險(xiǎn)。有研究[1]發(fā)現(xiàn)，在貿(mào)易市場(chǎng)的食肉動(dòng)物的SARS 冠狀病毒的抗體水平比農(nóng)場(chǎng)內(nèi)高，且陽性率達(dá)80%，可見無病原動(dòng)物經(jīng)過農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)后被感染的風(fēng)險(xiǎn)也隨之增加。即使是從有資質(zhì)的單位中購(gòu)進(jìn)試驗(yàn)動(dòng)物，在運(yùn)輸過程中也有可能被感染。隨著學(xué)院招生規(guī)模的擴(kuò)大，學(xué)生班級(jí)、人數(shù)正在不斷增多，試驗(yàn)動(dòng)物使用次數(shù)和使用時(shí)間都在增加，過度的使用往往會(huì)造成試驗(yàn)動(dòng)物免疫力的下降，從而在接觸野生動(dòng)物、節(jié)肢動(dòng)物等跨界動(dòng)物時(shí)就存在感染布魯氏桿菌?。ú疾。┑娘L(fēng)險(xiǎn)。

布魯氏桿菌病是由布魯氏桿菌引起的人畜共患傳染病。布魯氏桿菌病能感染多種動(dòng)物，牛、羊、豬最易感，犬、人也可感染。動(dòng)物患病后引起母畜流產(chǎn)、空懷和不孕，公畜發(fā)生睪丸炎癥狀；人感染后，多數(shù)病例有2 周左右的潛伏期，然后才開始出現(xiàn)癥狀，以波浪熱為特征的發(fā)熱、出汗及渾身乏力癥狀，隨著病情的加重關(guān)節(jié)出現(xiàn)腫痛，特別是下肢較為明顯，后期出現(xiàn)跛行，對(duì)病人的生殖系統(tǒng)產(chǎn)生一定的影響，表現(xiàn)為男性患睪丸炎，女性可能會(huì)出現(xiàn)卵巢炎、子宮內(nèi)膜炎等。布魯氏桿菌病是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織規(guī)定必須通報(bào)的動(dòng)物疫病“兩病”之一，《中華人民共和國(guó)動(dòng)物防疫法》將其列為二類動(dòng)物疫病，《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》將其列為乙類傳染病，并且該病在《國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃》（2012-2020年）與結(jié)核病、血吸蟲病、狂犬病等列入優(yōu)先防控的動(dòng)物疫病[2]。目前，由于基層動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督力量有限，逃避檢疫、私屠濫宰現(xiàn)象存在，給該病的防控工作帶來新的挑戰(zhàn)。為了掌握養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)場(chǎng)布魯氏桿菌病（布?。┑牧餍星闆r，保障動(dòng)物的健康及師生的安全。本試驗(yàn)對(duì)該場(chǎng)所有易感動(dòng)物進(jìn)行布魯氏菌病的血清學(xué)檢測(cè)，現(xiàn)將血清學(xué)檢測(cè)情況介紹如下。

1 材料與方法

1.1 組建檢測(cè)隊(duì)員

每次檢測(cè)啟動(dòng)前，由課題負(fù)責(zé)人根據(jù)團(tuán)隊(duì)學(xué)生的特長(zhǎng)和可利用的課余時(shí)間，靈活安排開展現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和采樣時(shí)間及人員分工，并負(fù)責(zé)檢測(cè)過程中遇到特殊問題及時(shí)與指導(dǎo)教師的協(xié)調(diào)和處置。

1.2 準(zhǔn)備檢測(cè)物品

手套、口罩、一次性注射器、離心管、推剪工具、75.0%酒精棉球、標(biāo)簽紙、記號(hào)筆、廢棄物收集桶等物品。

1.3 明確采血操作程序

采血最好選擇早上空腹?fàn)顟B(tài)下靜脈采集，采集后裝血的離心管斜面擺放，凝固后放入37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱1 h，接著放入4 ℃冰箱保存。牛采用尾根靜脈采血3～5 mL 即可；羊采用頸靜脈采血；犬采用正中靜脈采血，位于前肢腕關(guān)節(jié)前方2～3 cm 處?，F(xiàn)場(chǎng)采血時(shí)成員之間明確分工又齊心協(xié)作，一般是2人負(fù)責(zé)保定，1 人負(fù)責(zé)剪毛、消毒，并在動(dòng)物上作記號(hào)，1 人負(fù)責(zé)采血并注入離心管，另外1 人負(fù)責(zé)血樣編號(hào)和保存血樣[3]。由于采血是利用課余進(jìn)行，時(shí)間不多，每次只采集1 種動(dòng)物。

1.4 分離血清

待血清晰出后進(jìn)行血清分離，對(duì)有溶血或不釋出血清的動(dòng)物再重新采血，將分離好的血清進(jìn)行編號(hào)、分裝、放入-20 ℃冰箱冷凍備用。

受非洲豬瘟影響，采樣期間養(yǎng)殖場(chǎng)沒有豬只飼養(yǎng)，只采集了牛、羊、犬3 種易感動(dòng)物，共采集了牛8份、羊10 份、犬31 份，共計(jì)49 份血清。

1.5 檢測(cè)樣品

參照動(dòng)物布氏桿菌診斷技術(shù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

1）診斷液。布氏桿菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)和布氏桿菌病試管凝集試驗(yàn)抗原、陽性血清、陰性血清均購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所，按說明書進(jìn)行使用。

2）檢測(cè)方法。所有待檢血清先用虎紅平板凝集試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，篩選出的陽性血清樣品再用試管凝集試驗(yàn)進(jìn)行定性檢測(cè)，具體方法如下。

①虎紅平板凝集試驗(yàn)（PAT）方法及判定標(biāo)準(zhǔn)：參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T18646-2002 動(dòng)物布氏桿菌診斷技術(shù)的操作方法進(jìn)行操作。先在1 張潔凈的載玻片上滴加20 μL 抗原，隨后加入20 μL 待檢血清，攪拌混勻并攤成薄薄1 層，方便觀察結(jié)果。同時(shí)在玻片的另一端分別設(shè)立陽性和陰性血清對(duì)照。在4 min 內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見凝集現(xiàn)象且液體透明判為陽性；無凝集現(xiàn)象，且液體呈均勻粉紅色者判為陰性。

②試管凝集試驗(yàn)（SAT）方法及判定標(biāo)準(zhǔn)：參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T18646-20 動(dòng)物布氏桿菌診斷技術(shù)的操作方法進(jìn)行操作。首先稀釋血清，稀釋濃度依樣品的種類而定。羊血清稀釋梯度為1∶25、1∶50、1∶100、1∶200；牛血清的稀釋梯度為1∶50、1∶100、1∶200、1∶400；犬血清的稀釋梯度為1∶20、1∶40、1∶80、1∶160[4]。

隨后加入等量稀釋后的抗原，混合均勻。同時(shí)做陰性對(duì)照和陽性對(duì)照及抗原對(duì)照，并正確配置比濁管。將所有的試管、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照管及比濁管充分振蕩后放入37 ℃溫箱24 h 后，取出檢查并記錄好結(jié)果。參照比濁管，按各試管上層液體清亮度及管底凝集物的凝集程度判讀：“＋＋＋＋”表示菌體完全凝集，100%下沉，上層液體100%清亮；“＋＋＋”表示菌體幾乎完全凝集，上層液體75%清亮；“＋＋”表示菌體凝集顯著，液體50%清亮；“＋”表示菌體有凝集，液體25%清亮；“－”表示凝集物無沉淀，液體均勻混濁。

3）判定標(biāo)準(zhǔn)。虎紅平板凝集試驗(yàn)和試管凝集試驗(yàn)結(jié)果的判定是在陽性和陰性對(duì)照成立的前提下進(jìn)行?；⒓t平板凝集試驗(yàn)：待檢血清出現(xiàn)肉眼可見凝集塊，液體基本透明者判為陽性。試管凝集試驗(yàn)：牛待檢血清，稀釋度在1∶100 出現(xiàn)“＋＋”以上的凝集現(xiàn)象時(shí)，判為陽性；羊待檢血清，稀釋度在1∶50 出現(xiàn)“＋＋”以上的凝集現(xiàn)象時(shí)，判為陽性；犬待檢血清，稀釋度在1∶80 出現(xiàn)“＋＋”以上的凝集現(xiàn)象時(shí)判為陽性[5]。

2 結(jié)果與分析

由養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)場(chǎng)布氏桿菌病初檢及復(fù)檢結(jié)果可知（表1），49 份待檢血清通過布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，只有1 份犬血清判為可疑，其余判為陰性。對(duì)可疑血清的犬，在1 個(gè)月后重新采血、分離血清，進(jìn)行布氏桿菌病的試管凝集，結(jié)果仍為陰性，即49 份待檢血清通過布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)全部為陰性。

3 討 論

3.1 試驗(yàn)動(dòng)物布氏桿菌病的檢測(cè)不能放松

本次在養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)場(chǎng)抽檢的試驗(yàn)動(dòng)物均未感染布氏桿菌病，但防城港市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中[6]（2016年）抽取防港城4 個(gè)區(qū)（縣）160 份血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果陽性率為7.5%（12/160），可見當(dāng)時(shí)山羊布氏桿菌病的發(fā)病率較高。青海果洛州畜牧獸醫(yī)工作站達(dá)熱卓瑪[7]對(duì)藏羊布氏桿菌病的血清學(xué)調(diào)查，抽檢的樣本中感染率是0.1%，說明當(dāng)?shù)氐牟匮蛉褐羞€是存有布氏桿菌病。甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院王耀東等[8]對(duì)臨澤縣7 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的奶牛和肉羊布氏桿菌病的流行情況進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抽檢的樣本中牛陽性率達(dá)0.23%，羊陽性率達(dá)0.52%。這些研究數(shù)據(jù)表明，對(duì)待布氏桿菌病絕對(duì)不能掉以輕心，而必須要經(jīng)常性地開展布氏桿菌病的檢測(cè)和監(jiān)測(cè)，并繼續(xù)堅(jiān)持做好防控，才能確保為廣大師生提供健康安全的試驗(yàn)動(dòng)物。

表1 養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)場(chǎng)布氏桿菌病初檢及復(fù)檢結(jié)果

3.2 購(gòu)入試驗(yàn)動(dòng)物必須檢測(cè)布氏桿菌病

養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)場(chǎng)試驗(yàn)動(dòng)物最好自繁自養(yǎng)，以降低因引種而引發(fā)感染的風(fēng)險(xiǎn)。若需引種時(shí)，應(yīng)從無布氏桿菌病病原的地方購(gòu)買或有資質(zhì)的單位購(gòu)買，并做好檢疫工作，合格后才能引進(jìn)。引入后的畜禽群隔離觀察1 個(gè)月，并采血做布氏桿菌血清學(xué)檢測(cè)，判為陰性者方可混群飼養(yǎng)。每年進(jìn)行2 次常規(guī)性檢測(cè)，以確保動(dòng)物及師生的健康安全。

3.3 試驗(yàn)動(dòng)物生物安全管理需要更加嚴(yán)格

制定并執(zhí)行嚴(yán)格的管理制度，要定期對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)試驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行消毒、驅(qū)蟲以及免疫，確保動(dòng)物的健康情況；要科學(xué)飼養(yǎng)管理動(dòng)物，不同的試驗(yàn)動(dòng)物或試驗(yàn)?zāi)康牟煌脑囼?yàn)動(dòng)物均不得同室飼養(yǎng)；避免飼養(yǎng)人員直接接觸畜禽動(dòng)物，動(dòng)物飼養(yǎng)人員需要進(jìn)行定期的身體檢查；改善養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境及動(dòng)物欄舍的衛(wèi)生條件，做好平時(shí)常規(guī)消毒工作；師生使用試驗(yàn)動(dòng)物開展科研和實(shí)訓(xùn)時(shí)，一定要做好防護(hù)措施。

3.4 安全教育與培訓(xùn)必不可少

重視生物安全教育與培訓(xùn)是保證師生、試驗(yàn)動(dòng)物生物安全的基礎(chǔ)。師生在使用養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)場(chǎng)進(jìn)行科研、實(shí)訓(xùn)實(shí)驗(yàn)過程，人畜共患病生物風(fēng)險(xiǎn)無時(shí)無刻都有可能被觸及，只有安全有效的生物安全培訓(xùn)教育才能在思想上引起高度重視。因此，在每年都要對(duì)新生開展1 次生物安全相關(guān)的主題培訓(xùn)，讓學(xué)生充分認(rèn)識(shí)到人畜共患傳染病的危害性，實(shí)訓(xùn)過程的安全事項(xiàng)，平時(shí)的個(gè)人防護(hù)措施，被動(dòng)物咬傷或抓傷或被利器碰到時(shí)，如何科學(xué)合理處理傷口，只有安全措施到位才能確保師生和社會(huì)的安全。

3.5 防控機(jī)制建立非常必要

當(dāng)發(fā)生人畜共患病或動(dòng)物烈性傳染病時(shí)，需要徹底地對(duì)動(dòng)物飼養(yǎng)室與相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所實(shí)行消毒處理，殺滅昆蟲和鼠類，并即刻向?qū)W校主管部門、當(dāng)?shù)匦l(wèi)生防疫部門匯報(bào)，把疫情控制在最小的范圍內(nèi)，將危害降到最低。為了防止布氏桿菌病的流行和擴(kuò)散，發(fā)現(xiàn)布氏桿菌病時(shí)不進(jìn)行治理而是直接淘汰病畜。平時(shí)要堅(jiān)持“預(yù)防為主”的方針，具體做法：一是接種疫苗，提高家畜的免疫力以及對(duì)于該病的抵抗能力；二是源頭上徹底消滅傳染源，家畜每年進(jìn)行1 次檢測(cè)，而容易被感染的家畜每年進(jìn)行2 次檢測(cè)，如查發(fā)現(xiàn)有家畜被感染，采取撲殺并進(jìn)行無害化處理；三是切斷傳播途徑，如家畜接產(chǎn)都要防護(hù)安全，以免遭受不必要的感染，發(fā)現(xiàn)流產(chǎn)胎兒、胎衣等都應(yīng)及時(shí)清理深埋并做好消毒，防止可能的病原菌擴(kuò)散。家畜的肉蛋奶等食品生熟要分開放，要經(jīng)煮熟或衛(wèi)生檢驗(yàn)合格后才能采購(gòu)食用。

綜上所述，雖然目前沒有最佳的方法消滅布氏桿菌病，但依然可以采用有效的方法進(jìn)行防控，只要在平時(shí)多注意生物安全，確保養(yǎng)殖場(chǎng)衛(wèi)生，平時(shí)堅(jiān)持“預(yù)防為主”的方針，并留意養(yǎng)殖動(dòng)態(tài)，發(fā)現(xiàn)問題及時(shí)科學(xué)處理，就可以減少在使用動(dòng)物過程中或在養(yǎng)殖過程中布氏桿菌病對(duì)人畜的危害。