曹祁峰，任顯東，李閣錦，李冰*

(1. 錦州醫(yī)科大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121001；2. 錦州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 錦州 121001)

雞傳染性支氣管炎(chicken infectious bronchitis)是由冠狀病毒科、γ冠狀病毒屬的傳染性支氣管炎病毒(infections bronchitis virus，IBV)引起雞的一種急性、高度接觸性傳染病，該病主要侵害呼吸系統(tǒng)、消化道和泌尿生殖系統(tǒng)，是危害世界養(yǎng)禽業(yè)的傳染病之一[1]。冠狀病毒僅感染脊椎動(dòng)物，主要引起人和動(dòng)物的腸道及呼吸道疾病[2]。21世紀(jì)以來(lái)暴發(fā)的嚴(yán)重急性呼吸綜合征和中東呼吸綜合征以及新型冠狀病毒肺炎，使得該類病毒備受人們關(guān)注[3]。冠狀病毒可分為4個(gè)屬：α、β、γ、δ。α和β冠狀病毒主要為哺乳動(dòng)物病毒，γ冠狀病毒主要包括IBV、火雞冠狀病毒、白鯨冠狀病毒及其他禽類物種中分離到的冠狀病毒，其中造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的γ屬冠狀病毒主要為IBV與火雞冠狀病毒[4-5]。IBV是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒，于1930年在美國(guó)NorthDakota首次被分離；1931年Beaudette和Hudson首次對(duì)該病毒進(jìn)行文字報(bào)道；1956年Jungherr等利用中和試驗(yàn)證實(shí)IBV存在多個(gè)血清型，且不同血清型之間沒有交叉保護(hù)。1972年鄺榮祿等首次報(bào)道我國(guó)廣東省存在IBV，隨后雞傳染性支氣管炎在我國(guó)廣泛流行，每年對(duì)我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。

IBV屬于單股正鏈、含囊膜的RNA病毒，其核酸長(zhǎng)度約為27.6 kb，編碼纖突(S)蛋白、膜(M)蛋白、小包膜(E)蛋白和核(N)蛋白4種結(jié)構(gòu)蛋白和15個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(nsp2～16)，其中S蛋白是位于病毒粒子囊膜上的棒狀纖突結(jié)構(gòu)，具有十分重要的生物學(xué)功能[6]。IBV的S蛋白存在堿性氨基酸裂解位點(diǎn)，通常是由RRXRR/S(X為任意氨基酸)或HRRRR組成，成熟的S蛋白可以被宿主細(xì)胞的弗林蛋白酶切割成S1和S2亞基[7]。S1蛋白是中和抗體的主要誘導(dǎo)蛋白，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體、血凝抑制抗體，對(duì)IBV的感染性、致病性、組織嗜性及細(xì)胞嗜性起決定作用，也是決定IBV血清型的主要蛋白，因此S1基因核苷酸序列是IBV分離株分型的重要依據(jù)[8]。本研究通過對(duì)疑似病例進(jìn)行病毒的分離鑒定，并對(duì)S1基因進(jìn)行測(cè)序分析，初步明確了遼寧分離株遺傳演化特點(diǎn)，為遼寧地區(qū)雞傳染性支氣管炎的防控和疫苗的選擇提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來(lái)源及試驗(yàn)動(dòng)物

錦州某雞場(chǎng)3只疑似傳染性支氣管炎瀕死肉雞的腎臟病料樣品，由錦州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供；10日齡雞胚、14日齡未免疫雛雞，均購(gòu)于錦州鴻強(qiáng)牧業(yè)有限公司。

1.1.2 主要試劑

雞新城疫活疫苗(La Sota株)，購(gòu)自山東綠都生物科技有限公司；TRIzol試劑，購(gòu)自深圳市康初源有限公司；病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；Millipore超濾管，購(gòu)自北京強(qiáng)欣博瑞生物技術(shù)有限公司；pMD18-T載體、DNA連接酶、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，均購(gòu)自大連TaKaRa公司。Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit，購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病料的檢測(cè)

將臨床無(wú)菌采集的疑似IBV感染病料剪碎，與無(wú)菌PBS 1∶5倍混合并研磨，研磨液反復(fù)凍融3次，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，將樣品分為2份，一份置于-80 ℃冰箱保存，另一份按照TRIzol試劑方法提取病毒總RNA。參照Nguyen等[9]建立的針對(duì)N基因的RT-PCR方法進(jìn)行IBV檢測(cè)。上游引物5′-TG-GGTGACTCAATTCTGCTGTTGGACGTGTVCCTACACCA-3′,下游引物5′-GTCTACCAGGCATTCGCTTCCAGGAYCAGCARAAGAAGG-3′，產(chǎn)物片段大小386 bp。反應(yīng)體系為：1 μL上游引物、1 μL下游引物、3 μL cDNA、9 μL MixTaq酶、6 μL ddH2O。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后于72 ℃延伸10 min，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。采用PCR方法進(jìn)行新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV H5、H7、H9)、雞傳染性法氏囊病毒(IBDV)、禽白血病病毒(ALV)、禽腺病毒(FAdV)等病原檢測(cè)[10-13]。

1.2.2 病毒的增殖與EID50的測(cè)定

將上述檢測(cè)IBV陽(yáng)性樣品經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，加入雙抗置于4 ℃冰箱1 h后， 10日齡雞胚尿囊腔接種，0.3 mL/個(gè)，每次接種6枚雞胚，并設(shè)置生理鹽水對(duì)照組，置37 ℃孵化器孵化，棄去24 h內(nèi)死亡雞胚，72 h統(tǒng)一收胚，盲傳5代，回收尿囊液置于-80 ℃冰箱保存。取45枚10日齡雞胚，使用無(wú)菌PBS對(duì)第5代病毒液進(jìn)行稀釋，分別稀釋至10-1～10-8，雞胚尿囊腔接毒，每個(gè)梯度接種5枚雞胚，0.1 mL/個(gè)，對(duì)照組接種等劑量的無(wú)菌生理鹽水，37 ℃恒溫孵育，每天照蛋2次，棄去24 h內(nèi)死亡雞胚，144 h后統(tǒng)一收胚，根據(jù)24～144 h雞胚死亡情況及活胚有無(wú)發(fā)育受阻等特異性癥狀進(jìn)行綜合評(píng)估，利用Reed-Muench方法計(jì)算EID50。

1.2.3 病毒純化與血凝試驗(yàn)

取第5代雞胚尿囊液，12 000 r/min離心5 min，取上清經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，參照Millipore 超濾管使用說明對(duì)病毒液進(jìn)行純化，純化后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，? mL純化病毒液,將其分為A、B組，1 mL/組，A組加入等體積終濃度為3%的胰酶，37 ℃水浴3 h，每15 min震蕩1次，消化結(jié)束后加入1%胎牛血清終止胰酶作用；B組病毒液不處理，進(jìn)行血凝試驗(yàn)，測(cè)定血凝效價(jià)。

1.2.4 新城疫病毒抑制試驗(yàn)

將30枚10日齡雞胚分為3組，10個(gè)/組進(jìn)行尿囊腔接種。A組單獨(dú)接種新城疫La Sota株疫苗；B組先接種0.2 mL第5代尿囊液，12 h后再接種等劑量的新城疫La Sota株疫苗；C組接種生理鹽水作為對(duì)照組，37 ℃恒溫培養(yǎng)72 h。按常規(guī)方法測(cè)試各組血凝滴度。

1.2.5 S1基因克隆與測(cè)序

參照GenBank中公布的雞傳染性支氣管炎QXIBV毒株(NO.MN548289)的S1基因組序列設(shè)計(jì)特異性引物：上游引物5′-AAGAAGGAACAAAAGACCGACT-3′，下游引物5′-CAAAAWCTGCCATAACTAACATA-3′。按照病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書從第5代尿囊液中提取總RNA，按常規(guī)方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，采用PCR方法擴(kuò)增S1基因序列，退火溫度53 ℃，產(chǎn)物片段大小1 735 bp。按照膠回收試劑盒操作說明進(jìn)行目的條帶回收，將目的基因連接pMD18-T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取單菌落，接種于含氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR檢驗(yàn)，陽(yáng)性重組質(zhì)粒送生工生物工程股份公司測(cè)序，為了確保全基因序列的準(zhǔn)確性，每個(gè)陽(yáng)性質(zhì)粒測(cè)序3次。

1.2.6 S1基因序列遺傳進(jìn)化分析

以GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的IBV傳統(tǒng)疫苗株、流行毒株和國(guó)內(nèi)外部分經(jīng)典毒株作為本次研究的參考毒株，利用DNAStar 7.1軟件中MegAlign程序的ClustalW方法進(jìn)行序列比對(duì)及核苷核序列和氨基酸序列的同源性分析。參考文獻(xiàn)[14]中基于IBV S1基因的分型方法，采用MEGA 7.0軟件中Neighbor-Joining方法構(gòu)建基于S1基因序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.2.7 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

將40只14日齡未免疫健康雞平均分為2組，攻毒組和對(duì)照組，分別飼養(yǎng)于隔離飼養(yǎng)器內(nèi)。攻毒組使用分離株CH/LN/2019進(jìn)行滴鼻、點(diǎn)眼，接種劑量為0.2 mL；對(duì)照組以同等劑量的生理鹽水進(jìn)行滴鼻、點(diǎn)眼，分別置隔離器中飼喂21 d。攻毒后每天觀察雞只的精神狀態(tài)、食欲以及呼吸道是否出現(xiàn)臨床癥狀，對(duì)死亡雞只進(jìn)行剖檢。計(jì)算發(fā)病率和死亡率。

2 結(jié)果與分析

2.1 病料檢測(cè)

利用IBV的N基因特異性檢測(cè)引物分別對(duì)3份病料處理樣品進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，均見約386 bp的目的條帶(見圖1)，與預(yù)期片段大小一致，證明3份病料樣品中存在IBV。經(jīng)PCR鑒定未檢測(cè)到NDV、AIV、IBDV、ALV和FAdV(見圖2)。

M.DL2000 Marker;1～3. 疑似IBV病料;4. 陰性對(duì)照

M.DL2000 Marker;1. 陽(yáng)性對(duì)照;2. 陰性對(duì)照;3. 待測(cè)樣品

2.2 雞胚發(fā)育情況和EID50的測(cè)定

病毒液在10日齡雞胚尿囊腔接種后，傳至第3代時(shí)，雞胚發(fā)育明顯受到病毒抑制，出現(xiàn)死胚、侏儒胚等現(xiàn)象。胚體自氣室取出后，可觀察到胚體蜷縮，雙腳抱頭，羊膜增厚與胚體粘連，胚體體積明顯小于對(duì)照組。雞胚半數(shù)感染量測(cè)定時(shí)，根據(jù)雞胚病變情況與數(shù)量，采用Reed-Muench方法計(jì)算，分離株CH/LN/2019的EID50為105.66/0.1 mL。

2.3 血凝試驗(yàn)

A組病毒液經(jīng)3%胰酶處理后，可凝集雞紅細(xì)胞，血凝效價(jià)平均為26；B組未經(jīng)處理胰酶的病毒液，對(duì)雞紅細(xì)胞無(wú)凝集作用，證明該病毒液內(nèi)無(wú)具有血凝特性的外源性病毒。

2.4 新城疫抑制試驗(yàn)

單獨(dú)接種新城疫La Sota株疫苗的雞胚尿囊液血凝效價(jià)平均為27。先接種第5代尿囊液，再接種新城疫La Sota株疫苗的血凝效價(jià)平均為23。生理鹽水對(duì)照組無(wú)血凝特性。說明該分離株能抑制新城疫病毒在雞胚內(nèi)的增殖，符合IBV特性。

2.5 S1基因克隆與測(cè)序

采用本研究設(shè)計(jì)的S1基因特異性引物對(duì)第5代尿囊液進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，所得目的片段與預(yù)期片段大小一致(見圖3)。經(jīng)測(cè)序確定遼寧分離株S1基因核苷酸長(zhǎng)度為1 620 nt，基因序列已上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為MT292303，并將該分離毒株命名為CH/LN/2019。

M.DL2000 Marker;1. 第5代尿囊液;2. 陰性對(duì)照

2.6 S1基因遺傳演化、同源性分析與裂解位點(diǎn)分析

根據(jù)IBV S1基因序列繪制遺傳進(jìn)化樹，結(jié)果顯示(圖4)，分離株CH/LN/2019與參考毒株形成8個(gè)不同的進(jìn)化分支(基因型)，分別為CHⅠ～CHⅥ 型、Gray型和Mass型，分離株CH/LN/2019與CHⅠ型親緣關(guān)系最近。通過同源性對(duì)比發(fā)現(xiàn)，分離株CH/LN/2019與國(guó)內(nèi)的常規(guī)疫苗株H120、H52和MA5等核苷酸和氨基酸序列同源性分別為77.2%～76.9%和75.4%～76.2%；與CHⅠ型代表毒株QXIBV株核苷酸和氨基酸同源性分別為95.6%和94.8%；與基因Ⅱ型代表毒株4/91株核苷酸和氨基酸同源性分別為76.6%和78.3%。因此，可判定該分離株屬于以QXIBV株為代表的CHⅠ型(QX型)毒株。測(cè)序結(jié)果顯示，分離株CH/LN/2019 S1基因全長(zhǎng)為1 620 nt，編碼540個(gè)氨基酸。根據(jù)推導(dǎo)的氨基酸序列顯示，分離株的S1基因裂解位點(diǎn)為HRRRR，與CHⅠ型分支的所有參考毒株裂解位點(diǎn)一致，而疫苗株H120 S1基因長(zhǎng)度為1 611 nt，編碼537個(gè)氨基酸。這表明分離株CH/LN/2019的核苷酸存在基因插入和缺失的現(xiàn)象。利用DNAStar中的Megalign軟件對(duì)分離株CH/LN/2019與疫苗株H120核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，分離株CH/LN/2019分別在66～68、358～360和365～367位點(diǎn)插入了核苷酸TTC、ACA、TCT，因此推導(dǎo)其氨基酸序列差別較大。

2.7 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

人工感染CH/LN/2019毒株后，第3天攻毒組出現(xiàn)甩頭、口鼻流出漿液性黏液，第7～9 天出現(xiàn)閉目、呆立、羽毛蓬亂、張口呼吸、飲水顯著增加、排白色稀糞，第10天開始出現(xiàn)死亡，第16 天癥狀轉(zhuǎn)歸，第20天雞只恢復(fù)正常。剖檢病死雞只均呈現(xiàn)典型“花斑腎”現(xiàn)象，輸尿管內(nèi)有大量尿酸鹽沉積，氣管輕度出血并附著漿液性黏液，法氏囊腫大。攻毒組發(fā)病率100%，病死率為50%，對(duì)照組未出現(xiàn)癥狀與死亡。

3 討論

IBV的S蛋白是最重要的保護(hù)性抗原，同時(shí)也是變異最大的蛋白，S蛋白的抗原位點(diǎn)和高變區(qū)主要集中在S1蛋白上，當(dāng)S1蛋白發(fā)生基因缺失、插入、片段重組或點(diǎn)突變時(shí)會(huì)導(dǎo)致新的血清型和基因型出現(xiàn)和流行[15]。本研究通過臨床病料分離到1株IBV，并命名為CH/LN/2019。基于S1基因核苷酸以及推導(dǎo)的氨基酸序列遺傳演化分析，分離株CH/LN/2019與CH Ⅰ 型(QX型)的代表毒株同源性最高，分別為95.6%和94.8%，且具有相同的HRRRR裂解位點(diǎn)特征。IBV的S1蛋白是中和抗體的主要誘導(dǎo)蛋白，其含有3個(gè)高變區(qū)(HVRs)，分別位于38～67、91～141和274～387位氨基酸，含有特異性抗原中和表位[16]。相較于國(guó)內(nèi)常規(guī)疫苗株H120，分離株CH/LN/2019的S1基因在位于高變區(qū)的121、122位分別插入了氨基酸G和S，這些插入是導(dǎo)致分離株與疫苗株ORF長(zhǎng)度不同的主要原因。有研究表明IBV的S1基因在第269～298位氨基酸存在1處強(qiáng)親水區(qū)[17]，對(duì)比疫苗株H120，分離株在該區(qū)域出現(xiàn)大量氨基酸替換現(xiàn)象，說明該位置已經(jīng)出現(xiàn)了基因變異，這一點(diǎn)可能會(huì)影響IBV血清型及毒力的強(qiáng)弱。HVRs區(qū)域內(nèi)的核苷酸或氨基酸出現(xiàn)突變或位置改變時(shí)，都可能產(chǎn)生1個(gè)新的變異毒株，此外S1蛋白與IBV的組織嗜性有關(guān)[18-19]。但該分離株CH/LN/2019是否出現(xiàn)組織嗜性的改變有待進(jìn)一步研究。

▲為分離株;◇為疫苗株

IBV的基因分型主要聚焦于S1基因，分析S1基因序列有助于了解該地區(qū)IBV流行趨勢(shì)。Luo等[14]對(duì)2009—2010年國(guó)內(nèi)不同地區(qū)的38株野外毒株進(jìn)行S1基因遺傳進(jìn)化分析，將IBV劃分為分為7個(gè)基因型，分別為MASS型、CHⅠ(QX型)～CHⅥ型。趙燁[20]對(duì)國(guó)內(nèi)近20年IBV分型統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，我國(guó)每年70%以上的IBV病例都是由QX型引起。陳良珂等[21]對(duì)2013—2017分離的390株IBV進(jìn)行S1基因序列遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明，QX型是我國(guó)目前主要的優(yōu)勢(shì)基因型，另外CHⅤ型比例也在逐年上升。CHⅡ型與CHⅥ 型病毒在中國(guó)IBV分離株中所占比例相對(duì)穩(wěn)定(約占總分離株的15%)，CHⅢ型與CH Ⅳ型病毒所占比例較低且呈逐年下降趨勢(shì)[22]。本研究于2019年在遼寧地區(qū)分離得到了IBV CH/LN/2019株，參照Luo等[14]基于S1基因的分型方法，確定該分離株屬于QX基因型。由于QX型毒株與國(guó)內(nèi)當(dāng)前廣泛使用的MASS型疫苗親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，從而導(dǎo)致雞群免疫后仍不能完全抵御IBV流行毒株的侵襲[23]。我國(guó)臨床上針對(duì)該基因型已研制出雞新城疫-傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗(La Sota株+QXL87株)，該疫苗針對(duì)當(dāng)前QX型流行毒株可產(chǎn)生高達(dá)80%以上的免疫保護(hù)率[24]。建議各地區(qū)在防控雞傳染性支氣管炎時(shí)，應(yīng)根據(jù)當(dāng)?shù)亓餍卸局觐愋瓦x擇適合本地的疫苗，有助于提高疫苗的免疫保護(hù)率。