葉 樂,王海山,楊超杰,陳 治,胡清雨

1 熱帶海洋生物資源利用與保護教育部重點實驗室(海南熱帶海洋學院),三亞 572022 2 海南省熱帶海洋漁業(yè)資源保護與利用重點實驗室,三亞 572022

魚類的形態(tài)特征信息是魚類重要的分類依據(jù)之一,也是魚類育種品種持續(xù)改良、利用和保護的前提[1],因此,采集魚類形態(tài)特征信息是魚類育種的重要基礎(chǔ)工作。由于體質(zhì)量是揭示生長性能最直接的指標,因而成為魚類育種中重要的目標性狀,但在實際操作中,特別是對于個體較小的魚類,體質(zhì)量的測定需要精確的儀器且對操作環(huán)境也有比較嚴格的要求,另外,由于體表水分的影響測量誤差較大,所以,尋找更為準確快捷又與體質(zhì)量密切相關(guān)的指標成為許多研究工作的目標。通徑分析可以將基本變量的相關(guān)性分解成直接和間接影響,從而更好地理解這些性狀之間關(guān)聯(lián)的原因[2],為育種指標選取提供更可靠的依據(jù)。最近的研究表明,運用多元統(tǒng)計分析和通徑分析,可以闡明菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)[3]、凡納濱對蝦(Penaeusvannamei)[4]、克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)[5]、紅蟹(Charybdisferiata)[6]、牙鲆(Paralichthysolivaceus)[7]、小黃魚(Pseudosciaenapolyactis)[8]、斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)[9]和尖吻鱸(Latescalcarifer)[10]的形態(tài)性狀與體質(zhì)量的相關(guān)性,因而可以選擇形態(tài)性狀替換體質(zhì)量指標達到選育的目的。研究表明,魚類形態(tài)信息存在著種內(nèi)差異,與生境[11-12]、性別[13]、生長發(fā)育階段[7,14-15]相關(guān)。在自然生境中,魚類常受到饑餓的脅迫,因此,饑餓引起魚類生長、組織生理、代謝、行為等方面的影響研究是目前熱點研究領(lǐng)域[16- 18],而饑餓對魚類形態(tài)特征影響方面的研究相對匱乏[19]。

眼斑雙鋸魚(Amphiprionocellaris)俗稱公子小丑,是?？~亞科(Amphiprioninae)即小丑魚家族的一員,是重要的海水觀賞魚種類之一。小丑魚人工繁殖已經(jīng)可以量產(chǎn),但許多研究工作尚待開展,目前國內(nèi)對于眼斑雙鋸魚的報道僅見胚胎發(fā)育[20]、營養(yǎng)[21-22]和藥物應(yīng)激生理[23]等方面,國外則多聚焦于性轉(zhuǎn)化[24]、領(lǐng)域行為[25]和熱應(yīng)激[26]等問題。在小丑魚生產(chǎn)中已經(jīng)出現(xiàn)種質(zhì)退化生長緩慢現(xiàn)象,有必要開展快速生長品系的選育工作。由于個體差異和人為因素,養(yǎng)殖過程中某些個體可能會較長時間處于饑餓狀態(tài),目前,饑餓對眼斑雙鋸魚形態(tài)性狀與體質(zhì)量相關(guān)性的影響未見報道,是否對選育指標的選擇有影響也尚未可知。因此,本研究通過表型相關(guān)的通徑分析,研究饑餓對眼斑雙鋸魚幼魚形態(tài)性狀與體質(zhì)量的相關(guān)性影響,旨在評估饑餓和非饑餓狀態(tài)下影響眼斑雙鋸魚體質(zhì)量的主要形態(tài)性狀,及其各性狀對體質(zhì)量的直接作用、間接作用和決定作用,得出兩種狀態(tài)下體質(zhì)量與形態(tài)性狀的多元回歸方程,為眼斑雙鋸魚的選擇育種工作提供參考資料、奠定理論基礎(chǔ),同時為眼斑雙鋸魚生理生態(tài)學的研究積累基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與方法

實驗于2019年12月在海南熱帶海洋學院實驗室進行。實驗魚購自海南萬寧小丑魚繁殖場,選取同一批親魚產(chǎn)卵孵化培育的60d健康幼魚,打包充氧帶回實驗室,在實驗室暫養(yǎng)7d后隨機分到實驗養(yǎng)殖缸中。實驗設(shè)饑餓組和對照組,每組3個平行,每組30尾。養(yǎng)殖缸為60 cm×40 cm×40 cm玻璃缸,對照組正常投喂,每日投喂2次,饑餓組不投喂,其余養(yǎng)殖條件一致,循環(huán)水養(yǎng)殖,每天采用7w全光譜Led燈光照12h,水溫25—26℃。實驗進行7d,實驗結(jié)束后全部取樣,然后采用MS- 222麻醉劑進行麻醉后拍照和測量體質(zhì)量。

1.2 數(shù)據(jù)測量和分析方法

用吸水紙吸干實驗魚體表水分后用精度為0.001 g的電子天平測量體質(zhì)量(W,g),接著在體視顯微鏡下對每條魚進行正反面拍照,在電腦上用Image-Pro plus 6.0軟件準確測量每一尾幼魚的形態(tài)性狀(mm),包括全長(L1)、體長(L2)、體高(L3)、頭長(L4)、頭高(L5)、吻長(L6)、尾柄長(L7)、尾柄高(L8)、背鰭前距(L9)、胸鰭前距(L10)、腹鰭前距(L11)、臀鰭前距(L12)、眼徑(L13)等13個指標,精確至0.001 mm。

圖1 形態(tài)指標測量示意圖 Fig.1 Schematic diagram of morphological index measurementL1：全長,Total length；L2：體長,Standard length；L3：體高,Body depth；L4：頭長,Head length；L5：頭高,Head depth；L6：吻長,Snout length；L7：尾柄長,Caudal-peduncle length；L8：尾柄高,Caudal-peduncle depth；L9：背鰭前距,Pre dorsal length；L10：胸鰭前距,Pre pectoral length；L11：腹鰭前距,Pre pelvic length；L12：臀鰭前距,Pre anal length；L13：眼徑,eye diameter

測量的形態(tài)性狀指標如圖1所示,為減少操作誤差,所有樣品魚的形態(tài)指標由兩人分別測定,每人對魚體左右側(cè)所有指標各測定一次,綜合兩人測定的4組數(shù)據(jù)取平均值作為最后數(shù)值用于統(tǒng)計分析。

運用IBM SPSS statistics 25軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計算各性狀的平均值和標準差。各性狀變異系數(shù)(CV)的計算公式：

CV=(標準差/平均值)×100%

先對因變量(體質(zhì)量)進行正態(tài)性檢驗,檢驗合格后采用Pearson法對各形態(tài)性狀與體質(zhì)量進行相關(guān)分析; 在此基礎(chǔ)上運用逐步引入-剔除法建立形態(tài)性狀與體質(zhì)量的多元線性回歸方程,通過形態(tài)性狀對體質(zhì)量的通徑系數(shù)和間接通徑系數(shù),分析各形態(tài)性狀對體質(zhì)量的直接作用和間接作用。

決定系數(shù)計算公式：

di=Pi2；dij= 2rij×Pi×Pj

式中,di是單個性狀i對體質(zhì)量的影響,dij是性狀i和j對體質(zhì)量的影響,rij是性狀i和j之間的相關(guān)系數(shù),Pi,Pj分別是單個性狀i,j對體質(zhì)量的通徑系數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)正態(tài)性驗證

對因變量W(體質(zhì)量)進行正態(tài)性檢驗,結(jié)果顯示Shapiro-Wilk 顯著性大于0.05,Kolmogorov-Smirnov顯著性為0.200(真顯著性下限),數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布,可以對體質(zhì)量與形態(tài)特征進行回歸分析。

2.2 表型數(shù)據(jù)描述性統(tǒng)計

對眼斑雙鋸魚幼魚體質(zhì)量和形態(tài)性狀數(shù)據(jù)進行描述性統(tǒng)計,結(jié)果見表1。對照組和饑餓組變異系數(shù)最大的均為W(體質(zhì)量)參數(shù)(32.651%和34.063),而形態(tài)性狀中變異系數(shù)最大的是L6(吻長,25.486%和20.689%),最小的是L13(眼徑,8.708%和7.339%)。

表1 表型性狀的描述性統(tǒng)計

2.3 各性狀間的相關(guān)性分析

對饑餓組和對照組眼斑雙鋸魚幼魚表型數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析,結(jié)果表明,各性狀間均存在顯著相關(guān)關(guān)系,達到極顯著水平(P<0.01)(表2),說明形態(tài)性狀對體質(zhì)量以及這些性狀之間存在線性相關(guān)。對照組形態(tài)性狀對體質(zhì)量相關(guān)系數(shù)的大小順序(r)為L3>L2>L1>L9>L5>L10>L8>L12>L11>L4>L13>L6>L7,饑餓組形態(tài)性狀對體質(zhì)量相關(guān)系數(shù)的大小順序(r)為L3>L1>L2>L5>L8>L4>L10>L12>L11>L9>L13>L6>L7。對照組和饑餓組中與體質(zhì)量相關(guān)系數(shù)最高的性狀均為體高,而其它形態(tài)性狀與體質(zhì)量相關(guān)系數(shù)排序兩個組間存在一定的差別。

表2 表型性狀之間的相關(guān)性分析及顯著性檢驗

2.4 通徑分析結(jié)果

對照組和饑餓組形態(tài)性狀對體質(zhì)量的通徑系數(shù)見表3。剔除經(jīng)共線性診斷共線性嚴重的變量和對體質(zhì)量影響不顯著的變量,對照組結(jié)果保留了L3、L2、L6和L5等4個形態(tài)性狀變量,饑餓組結(jié)果保留了L3、L12、L2、L7和L6等5個形態(tài)性狀變量,所選性狀對體質(zhì)量的影響達到極顯著水平(P<0.01)。根據(jù)成分效應(yīng),相關(guān)系數(shù)可分為直接作用(通徑系數(shù))和間接作用(間接通徑系數(shù))兩部分。對照組直接作用由大到小排序依次為：L3>L2>L6>L5,間接作用排序為：L5>L6>L2>L3；饑餓組直接作用由大到小排序依次為：L3>L2>L12>L6>L7,間接排序為：L7>L12>L2>L6>L3?？梢?對照組和饑餓組中體高的直接作用均為最大(分別為0.718和0.574),間接作用均為最小,也是所篩選出的形態(tài)性狀中唯一的間接作用小于直接作用的性狀；第二大直接作用均為體長(分別為0.432和0.314)；對照組直接作用最小為頭高(-0.276),對體質(zhì)量影響呈負向作用,但其間接作用最大(1.184),饑餓組直接作用最小為尾柄長(-0.178),同樣呈負向作用,其間接作用也最大(0.730)。

表3 相關(guān)系數(shù)分解

2.5 形態(tài)性狀對體質(zhì)量的決定程度

對照組和饑餓組各形態(tài)性狀對體質(zhì)量的決定系數(shù)分別見表4。表中,相同性狀對應(yīng)的數(shù)值為其對體質(zhì)量的單獨決定系數(shù),兩個不同性狀對應(yīng)的數(shù)值為它們對體質(zhì)量的共同決定系數(shù)。從表中可看出,對體質(zhì)量的單獨決定系數(shù)由大到小排序?qū)φ战M分別為L3>L2>L5>L6,饑餓組為L3>L2>L12>L7>L6,可見,對照組和饑餓組單獨決定系數(shù)最大均為體高,其次為體長,單獨決定系數(shù)最小均為吻長。對照組和饑餓組共同決定系數(shù)最大的均為L3L2,即體高和體長對體質(zhì)量的共同決定作用最大。共同決定系數(shù)最小的對照組為L3L5(體高和頭高)(-0.368),饑餓組為L3L7(體高和尾柄長)(-0.136),均為負向作用。兩組體高的單獨決定系數(shù)和與其它性狀共同決定系數(shù)總和均為最高,說明不管魚體饑餓狀態(tài)如何,體高都是決定體質(zhì)量最主要的因素。所有單獨決定系數(shù)和兩性狀共同決定系數(shù)的總和為所篩選性狀的總決定系數(shù),對照組為0.930,饑餓組為0.941。由總決定系數(shù)計算剩余因子,對照組e=0.2638,饑餓組e=0.2310,說明兩個實驗組體質(zhì)量決定因子除了篩選出的上述形態(tài)性狀外,還有其它影響較小的因子。

2.6 多元回歸方程構(gòu)建

通過多元回歸分析,剔除經(jīng)共線性診斷共線性嚴重的變量和對體質(zhì)量影響不顯著的變量,分別建立了對照組和饑餓組形態(tài)性狀與體質(zhì)量關(guān)系的多元回歸方程：

W=-0.819+0.106L3+0.027L2+0.006L6-0.050L5(R2=0.941,F=267.294,P=0.000)；
W=-0.778+0.078L3+0.016L12+0.015L2-0.055L7+0.018L6(R2=0.930,F=267.294,P=0.000)。

上述回歸方程多重相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.85,表明所選的形態(tài)性狀分別是影響對照組和饑餓組眼斑雙鋸魚幼魚體質(zhì)量的關(guān)鍵因子。F檢驗結(jié)果顯示,上述回歸方程的回歸關(guān)系均達極顯著水平(P=0.000<0.01)；t檢驗結(jié)果顯示,上述回歸方程的形態(tài)性狀對體質(zhì)量的偏回歸系數(shù)均達顯著或極顯著水平(P<0.01或(P<0.05) (表5),所以總體回歸方程是顯著的。預(yù)測標準殘差平均值及其標準差對照組為0.000±0.967,饑餓組為0.000±0.976,表明建立的多元回歸方程較好的擬合了樣本觀測值。

表4 形態(tài)性狀對體質(zhì)量的決定系數(shù)

表5 模型的系數(shù)及其t檢驗結(jié)果

3 討論

相關(guān)性分析表明,所測量的13個眼斑雙鋸魚幼魚形態(tài)性狀與體質(zhì)量均存在極顯著相關(guān)關(guān)系(P<0.01),顯然,僅用相關(guān)分析不能客觀描述性狀間的相互關(guān)系,不能把最重要的表型性狀篩選出來。所以為了剔除不必要的指標,有必要進行通徑分析,最終找出影響幼魚體質(zhì)量的主要關(guān)鍵性狀。通徑分析可以將自變量對因變量的總影響分為直接影響和間接影響,并能充分反映性狀之間關(guān)聯(lián)的原因[2]。一般來說,只有當自變量的表型相關(guān)系數(shù)達到因變量的顯著水平時,才可以選擇該自變量,否則,應(yīng)將其排除在外[27]。在通徑分析和決定系數(shù)分析中,當相關(guān)性狀決定系數(shù)的總和(R2)大于或等于0.85時,表明找到主要自變量[28]。本研究未饑餓對照組和饑餓組分別篩選出4和5個形態(tài)性狀,它們對體質(zhì)量總的決定系數(shù)均大于0.85,表明眼斑雙鋸魚體質(zhì)量變異主要是由這些形態(tài)性狀決定的,它們分別代表未饑餓和饑餓狀態(tài)下直接或間接影響眼斑雙鋸魚體質(zhì)量的關(guān)鍵因子。

本研究發(fā)現(xiàn),饑餓脅迫影響著眼斑雙鋸魚幼魚形態(tài)性狀與體質(zhì)量的相關(guān)性,在非饑餓狀態(tài)下體高、體長、吻長和頭高等4個形態(tài)性狀是決定魚類體質(zhì)量的主要性狀,而饑餓狀態(tài)下體高、臀鰭前距、體長、尾柄長和吻長等5個形態(tài)性狀是體質(zhì)量主要的影響因子。此前研究表明,魚類形態(tài)性狀對體質(zhì)量的影響存在種間差異,如對于二齡草魚(Ctenopharyngodonidellus) 體寬是最主要因素[27]；轉(zhuǎn)基因鯉則是體長和體高[28]；野生小黃魚體長對體質(zhì)量的影響最大[8]；而對于 4月齡斜帶石斑魚,全長是最主要因素[9]。種內(nèi)不同生長階段也存在明顯差異,如6月齡大菱鲆(Scophthalmusmaximus),全長、體高、體厚和頭長對體質(zhì)量影響最大,而14月齡為全長、體厚和尾柄寬[14]；大瀧六線魚(Hexagrammosotakii)6月齡為體長、頭長、體高和體寬,而18月齡則為全長、體高、尾柄高和體寬[15]。另外,種內(nèi)形態(tài)性狀還表現(xiàn)群體差異和兩性異形,如羅非魚(Oreochromisniloticus)[11]和麗體魚屬的Cichlasomafestae[12]的野生群體和人工養(yǎng)殖群體之間的形態(tài)性狀均存在顯著差異；鯰魚(Silurusasotus)和胡子鯰(Clariasfuscus)形態(tài)特征存在兩性異形[13],這些種內(nèi)形態(tài)性狀差異對其與體質(zhì)量的相關(guān)性也可能有影響。目前已經(jīng)證實環(huán)境因子對魚類形態(tài)性狀有影響,如曾令清等(2017)[29]研究發(fā)現(xiàn)鳊幼魚表型特征之間存在關(guān)聯(lián),且受環(huán)境條件的影響。由于生存環(huán)境和人為因素常導致魚類處于饑餓的脅迫狀態(tài),對其能量代謝和行為[18,30]、魚體成分[31]、生理生化[32]、游泳能力[17,33]等產(chǎn)生顯著影響。魚類形態(tài)結(jié)構(gòu)與機能是相協(xié)調(diào)的,因此饑餓狀態(tài)下可能存在魚體形態(tài)變化適應(yīng)策略。研究發(fā)現(xiàn),中華倒刺鲃(Spinibarbussinensis)仔魚隨著饑餓程度增加,體長和體高均顯著下降[34],而鯉幼魚饑餓后體高變化較其他參數(shù)明顯,導致體高/體長明顯下降,體型變得更加“細長”[19]。這種體型的變化可能是饑餓狀態(tài)下肌肉營養(yǎng)物質(zhì)大量消耗以維持生命造成的,但這種變化也可能有利于降低魚類游泳過程中能量消耗[35],體現(xiàn)了魚類對饑餓脅迫的形態(tài)適應(yīng)。而本研究證實眼斑雙鋸魚幼魚對饑餓脅迫的形態(tài)適應(yīng),影響了其形態(tài)性狀與體質(zhì)量的相關(guān)性,但饑餓和非饑餓狀態(tài)下的幼魚也有共同的體質(zhì)量決定因子,即體高、體長和吻長,其中體高在兩種狀態(tài)下都是最主要的決定因子。

為盡可能減少人為誤差,許多形態(tài)測量研究取樣的樣本量都比較大,幾百甚至幾千尾,這樣增加了工作量,另外形態(tài)測定時間過長難免造成魚類死亡,本研究對常規(guī)測量方法做了改進,不采用游標卡尺現(xiàn)場測定,而是在使用麻醉劑麻醉后拍照,再用電腦軟件測量,精確度高,而且對于同一批實驗樣本,采用2人測定正反面數(shù)據(jù)取平均值再統(tǒng)計,更進一步消除了人為誤差,使得結(jié)果更為可信。同時可以減少取樣量,實驗魚在拍照和測量體質(zhì)量后即可放回水體中,用時極短,很大程度上減少測量操作造成魚類的損傷。

4 結(jié)論與建議

本研究應(yīng)用通徑分析技術(shù)探索了饑餓和非饑餓狀態(tài)下13個形態(tài)性狀之間及其與體質(zhì)量的相互依賴關(guān)系,有助于比較客觀地分析和解釋這些性狀之間的相關(guān)模式。研究證實饑餓脅迫影響了眼斑雙鋸魚幼魚形態(tài)性狀與體質(zhì)量的相關(guān)性,但饑餓和非饑餓狀態(tài)下體高、體長和吻長都是影響體質(zhì)量的關(guān)鍵因子,因此不論眼斑雙鋸魚幼魚饑餓程度如何,可以均選擇它們作為該魚選育快速生長品系的重要參考性狀,當然,這些形態(tài)計量性狀應(yīng)與遺傳研究相結(jié)合,提供這些變量與體質(zhì)量的遺傳力和遺傳相關(guān)性的信息。