朱買勛，唐紅梅，閆志強(qiáng)，陳春林，翟少欽

(重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460)

病毒的高度變異和抗病毒藥物的缺乏，增加了畜禽病毒性疫病的防控難度，尋求具有選擇性殺滅病毒而不損傷畜禽機(jī)體細(xì)胞的藥物是有效防控畜禽疫病的主要手段。中藥是中國流傳數(shù)千年的瑰寶，基于長期的臨床經(jīng)驗來篩選和研究有效抗病毒的藥物，實(shí)現(xiàn)“老藥”新用是現(xiàn)代挖掘抗病毒方法的有效途徑，有助于抗病毒類新獸藥的研發(fā)。雞傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)引起的一種免疫抑制病，該病在全球范圍內(nèi)廣泛傳播，并且可以通過垂直傳播和水平傳播的方式進(jìn)行擴(kuò)散[1-2]。IBDV屬于雙RNA病毒科禽雙 RNA 病毒屬，基因組包括兩條雙鏈RNA，編碼的氨基酸區(qū)段存在高變區(qū)(Hypervariable region，HVR)，已經(jīng)從原來的經(jīng)典毒株漸漸變異成IBDV超強(qiáng)毒株(Very virulent IBDV,vvIBDV)，僅2018年，中國黑龍江、遼寧、河北、山東、江蘇、浙江、云南7個省檢測到 IBDV 新型變異株的流行，并在不斷蔓延[3]。美國紐約也分離出包含vvIBDV的新型毒株，且感染4周齡SPF雞，能在4 d內(nèi)達(dá)到100%發(fā)病和68.7%死亡[4-5]，發(fā)病雞法氏囊壞死并免疫抑制，免疫系統(tǒng)被嚴(yán)重?fù)p害，嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展[6-7]。2020年，OIE將vvIBDV造成的疫病列為117種烈性傳染病之一[8]。

對IBD的防控，現(xiàn)在主要以接種疫苗進(jìn)行預(yù)防為主，但由于病毒表面蛋白存在連續(xù)突變風(fēng)險，導(dǎo)致免疫失敗，產(chǎn)生免疫盲區(qū)。藥物預(yù)防也是防治IBD的主要手段，尤其是中獸藥，富含大量的營養(yǎng)成分和天然活性物質(zhì)，在增強(qiáng)動物免疫力和抗病毒方面均有其獨(dú)特效果。能干擾IBDV的復(fù)制和阻滯其穿入宿主細(xì)胞[9]，提高外周血和脾淋巴細(xì)胞中CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞百分率，改變CD4+/CD8+比值，促進(jìn)對機(jī)體免疫系統(tǒng)的調(diào)控[10]，提高抗體效價，有效保護(hù)雛雞法氏囊、胸腺和脾臟等免疫器官，減輕病毒對其的損傷程度[11]，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)防治IBDV的效果。本研究在中藥復(fù)方提取物可以增強(qiáng)免疫抑制雛雞的免疫功能和提高IBD疫苗免疫效果的基礎(chǔ)上[12-13]，采用IBDV人工感染SPF雞，旨在進(jìn)一步明確中藥復(fù)方提取物防治IBDV的效果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

中藥提取物(Traditional Chinese medicine extract，簡稱TCME)，按2∶2∶1∶1的質(zhì)量比稱取女貞子(LigustriLucidiFructus)、黃芪(AstragaliRadix)、枸杞子(LyciiFructus)、菟絲子(CuscutaeSemen)，經(jīng)過水提取、過濾，制備成浸膏，添加可溶性淀粉制成規(guī)格為每1.0 g提取物中含1.0 g的原生藥。

雞傳染性法氏囊病毒(CVCC編號：AV7)購于中國獸醫(yī)微生物菌種保存中心，由重慶市畜牧科學(xué)院獸醫(yī)獸藥研究所擴(kuò)增保存。

SPF雞胚和SPF雛雞均購于濟(jì)南斯派瑞福禽業(yè)科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 病毒EID50的測定 利用雞胚測定病毒滴度， 10倍稀釋法用PBS將IBDV種毒稀釋10個梯度，每個梯度病毒稀釋液分別接種9～11日齡SPF雞胚的尿囊腔，每個梯度接種7胚，接種量為每胚100 μL，另選7胚接種等量的PBS作為陰性對照，37 ℃培養(yǎng)，接種后每天照蛋觀察雞胚發(fā)育情況，記錄死胚數(shù)量，并采集雞胚尿囊液進(jìn)行ELISA檢測(購于武漢Abebio公司)，接種后第7天，存活的胚胎處死后，檢測判定雞胚是否為陽性。參照Reed-Muench法[14]計算病毒EID50。EID50=10-[A+(B-50)/(B-C)]

式中：A為高于50%的病毒稀釋度；B為高于50%的百分?jǐn)?shù)，C為低于50%的百分?jǐn)?shù)。

1.2.2 動物分組及管理 分組及飼養(yǎng)管理：150羽3周齡的SPF雛雞，預(yù)飼1周后，隨機(jī)分為5個組，分別為對照組、模型組和中藥提取物高、中、低劑量組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)10羽雛雞。各組雛雞采用單籠立式隔離飼養(yǎng)，自由飲水，飼喂相同的飼料。

給藥：中藥提取物高、中、低劑量組分別在飲水中添加10.0、5.0、2.5 g/L的中藥提取物，連續(xù)添加7 d，對照組和模型組不添加任何藥物。

攻毒：給藥完成后，試驗組雛雞分別通過滴鼻接種含100 EID50/100 μL的IBDV，對照組滴鼻等量的生理鹽水。攻毒后，連續(xù)2周觀察雛雞的生存狀態(tài)。

1.2.3 雛雞的生存分析 在整個試驗期間，觀察雛雞的臨床變化，稱量體質(zhì)量，統(tǒng)計雛雞每天的死亡情況，計算每組雛雞的成活率(S)。

S=(N-D)/N×100%

N為試驗動物數(shù)；D為死亡動物數(shù)。

1.2.4 樣品的采集與處理 攻毒后2周，空腹 8 h稱量雛雞體質(zhì)量，之后脫臼處死雛雞，無菌解剖，采集完整的胸腺、脾臟和法氏囊，稱量質(zhì)量，計算免疫器官指數(shù)，稱量之后剪碎，迅速放入液氮中保存，同時多點(diǎn)采集心臟、肝臟、肺臟、腎臟、肌肉(胸部和腿部)等組織，剪碎后迅速放入液氮保存，用于提取組織中病毒RNA。

I=Iw/Aw

I為免疫器官指數(shù)；Iw為免疫器官質(zhì)量(mg)；Aw為試驗動物體質(zhì)量(g)。

1.2.5 臟器中病毒載量檢測 根據(jù)GenBank中IBDV毒株全基因序列，設(shè)計擴(kuò)增IBDVVP2基因的引物，上游引物：5′-TCCTTCTACAACGCTATCA-3′，下游引物：5′-TACCTCGTACCCCTTGTC-3′，內(nèi)參基因β-actin上游引物：5′-GCCAACAGAGAGAAGATGACAC-3′，下游引物：5′-GTAACACCATCACCAGAGTCCA-3′，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，各組雛雞的肝臟、肺臟、胸腺、脾臟、法氏囊、腎臟、肌肉(胸部和腿部)等組織采用液氮冷凍研磨，提取RNA，通過核酸蛋白定量檢測儀測定提取的病毒RNA的質(zhì)量濃度和純度，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。對VP2和內(nèi)參基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，VP2基因擴(kuò)增產(chǎn)物分別稀釋成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10等不同質(zhì)量濃度的模板，添加SYBR Primix ExTaqMix(2×) 10 μL，上下游引物各0.5 μL，不同質(zhì)量濃度PCR產(chǎn)物模板1 μL，加ddH2O補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)條件為： 94 ℃ 2 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s， 30個循環(huán)；75 ℃延伸10 min，每個循環(huán)后進(jìn)行讀板，反應(yīng)結(jié)束后系統(tǒng)自動生成熔解曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線后，樣品均采用10 μL體系進(jìn)行熒光定量檢測。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0中GLM模塊進(jìn)行方差分析；組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義時，采用Duncan’s法進(jìn)行多重比較。熒光定量PCR試驗中，為降低RNA定量、反轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)效率的差異對結(jié)果的影響，VP2基因表達(dá)強(qiáng)度分別以絕對拷貝數(shù)/β-actin絕對拷貝數(shù)表示。將模型組的表達(dá)量設(shè)置為100倍，計算其他組雛雞各免疫器官中相應(yīng)基因相對于模型組的表達(dá)變化。數(shù)據(jù)以“平均值+標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒EID50測定結(jié)果

由表1可知，按照Reed-Muench法計算得出IBDV病毒液EID50為1×10-6.91/100 μL。

表1 病毒EID50的測定結(jié)果Table 1 The measurement results of viral EID50

2.2 雛雞成活率

由表2可知，對照組雛雞未出現(xiàn)死亡，成活率為100%。攻毒后第3天，除中劑量組外，其他組雛雞開始出現(xiàn)死亡，攻毒后第4天～第7天為死亡高峰期，之后維持相對穩(wěn)定狀態(tài)。試驗結(jié)束后，模型組雛雞成活率低至30.00%，高劑量組為 86.67%，中劑量組為93.33%，低劑量組為 70.00%，說明中藥提取物能提高雛雞的成活率。

表2 成活雛雞統(tǒng)計結(jié)果(n=30)Table 2 Statistical results of survival chicks(n=30)

2.3 免疫器官指數(shù)變化

由表3可知，雛雞在接種IBDV后，模型組雛雞的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、法氏囊指數(shù)顯著高于對照組(P<0.05)，而使用中藥提取物進(jìn)行預(yù)防的雛雞脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、法氏囊指數(shù)明顯降低，高劑量組雛雞脾臟指數(shù)顯著低于模型組和低劑量組(P<0.05)，法氏囊指數(shù)顯著低于模型組(P<0.05)。中劑量組胸腺指數(shù)顯著低于模型組和低劑量組(P<0.05)，法氏囊指數(shù)顯著低于模型組(P<0.05)。

表3 雛雞免疫器官指數(shù)Table 3 The results of chicks’ immune organ index

2.4 病毒在組織中分布結(jié)果

由表4可知，雛雞在接種IBDV后，IBDV能在肝臟、脾臟、腎臟、法氏囊、胸腺的組織中分布，對使用中藥提取物預(yù)防后的雛雞進(jìn)行組織中病毒核酸檢測，結(jié)果顯示高劑量組雛雞的腎臟、肺臟、肌肉組織中病毒核酸均為陰性，脾臟組織部分為陰性，肝臟、法氏囊、胸腺組織均為陽性。中劑量組和高劑量組雛雞的腎臟、肺臟、肌肉組織均為陰性，脾臟和法氏囊組織部分為陰性，肝臟和胸腺組織為陽性。低劑量組只有肺臟和肌肉組織為陰性，腎臟組織部分為陰性，法氏囊、脾臟、肝臟、胸腺組織均為陽性。

表4 雛雞組織中病毒核酸檢測結(jié)果Table 4 Detection results of viral nucleic acid in chick tissues

2.5 免疫器官中IBDV的載量分析

由圖1～3可知，對照組雛雞的脾臟、胸腺和法氏囊中均未檢測到IBDV，表明雛雞未感染病毒。以模型組為基準(zhǔn)，高劑量、中劑量和低劑量組的雛雞脾臟組織中IBDV載量分別降至模型組的(0.26±0.08)、(0.20±0.06)、(0.86±0.16)倍，高劑量組和中劑量組極顯著低于模型組和低劑量組(P<0.01)；胸腺組織中IBDV載量分別降至(0.46±0.07)、(0.34±0.08)、(0.78±0.09)倍，高劑量組和中劑量組極顯著低于模型組和低劑量組(P<0.01)，低劑量組顯著低于模型組(P< 0.05)；法氏囊組織中IBDV載量分別降至 (0.59±0.11)、(0.44±0.05)、(0.80±0.10)倍，高劑量組和中劑量組極顯著低于模型組 (P<0.01)，且顯著低于低劑量組(P<0.05)，低劑量組顯著低于模型組(P<0.05)。

3 討論與結(jié)論

傳染性法氏囊病常發(fā)生于3～12周齡的雛雞或青年雞，IBDV入侵后主要在免疫器官內(nèi)大量繁殖，破壞免疫器官并導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制，降低雛雞的抗病能力和對疫苗的免疫應(yīng)答能力，甚至引起死亡[1]。本研究中，中藥提取物高、中、低劑量組雛雞成活率分別達(dá)到86.67%、93.33%和 70.00%，高劑量組雛雞脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)顯著低于模型組和低劑量組(P<0.05)，中劑量組胸腺指數(shù)和法氏囊指數(shù)顯著低于模型組 (P<0.05)，說明中藥提取物能有效緩解由于IBDV感染引起的免疫器官炎癥，改善雛雞免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用，降低雛雞的死亡率。本研究中，中藥提取物由女貞子、黃芪、枸杞子、菟絲子等中藥組方后提取制備而成，含有大量的黃芪多糖、枸杞多糖、女貞子多糖等生物活性物質(zhì)，其作用機(jī)制可能是這些生物多糖具有增強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能、營養(yǎng)免疫器官的功效，從而改善了IBDV感染引起的損傷，增強(qiáng)機(jī)體的抗病能力，達(dá)到提高雛雞成活率的效果。

IBDV在雛雞體內(nèi)的生長繁殖與機(jī)體的抵抗能力存在一定的對抗關(guān)系。IBDV入侵雛雞后，在肝臟、脾臟、腎臟、法氏囊、胸腺等組織中廣泛分布并繁殖，造成組織損傷和功能抑制。本研究采用中藥提取物防治的雛雞，IBDV在組織中的生長繁殖發(fā)生改變，高劑量組雛雞的腎臟組織全部轉(zhuǎn)為陰性，脾臟組織部分轉(zhuǎn)為陰性，中劑量組雛雞的腎臟組織全部轉(zhuǎn)為陰性，脾臟和法氏囊組織部分轉(zhuǎn)為陰性。分析IBDV在脾臟、胸腺和法氏囊組織中的載量，中藥提取物高劑量組和中劑量組雛雞的脾臟、胸腺、法氏囊中載毒量極顯著低于模型組(P<0.01)，脾臟、胸腺組織中病毒載量極顯著低于低劑量組(P<0.01)，法氏囊組織中病毒載量顯著低于低劑量組(P<0.05)，提示中藥提取物可以促進(jìn)機(jī)體清除IBDV。在雛雞清除病毒的過程中，中藥提取物可以通過調(diào)節(jié)機(jī)體分泌大量的細(xì)胞因子參與免疫調(diào)節(jié)和抗病毒作用，中藥提取物中含有大量的多糖，黃芪多糖可以促進(jìn)雞脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2、TNF-β、IFN-γ、IL-4、IL-6等多種細(xì)胞因子[15]，枸杞多糖可以提高雛雞的免疫力，增強(qiáng)IL-2、IL-6基因mRNA的表達(dá)[16]。這些細(xì)胞因子主要由Th1和Th2分泌，在抗病毒過程中積極調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫，增強(qiáng)機(jī)體的抗病毒能力[7]。但是部分雛雞的免疫器官中IBDV仍然為陽性，尤其是低劑量組，由此可以推斷該中藥提取物對病毒的清除與藥物使用劑量存在一定的關(guān)系，較低劑量的中藥提取物對IBDV感染雛雞的防治效果不佳，臨床中防治IBDV時要制定雞場的科學(xué)用藥程序，有助于提高IBD的防治效果。