陳瑤，張偉富，任恒澤，熊飛，張豪杰，姚利娜，劉瑩，王璐，王新超，楊亞軍，郝心愿

茶樹DNA去甲基化酶基因的全基因組鑒定及表達(dá)分析

陳瑤，張偉富，任恒澤，熊飛，張豪杰，姚利娜，劉瑩，王璐，王新超，楊亞軍*，郝心愿*

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/國家茶樹改良中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶樹生物學(xué)與資源利用重點(diǎn)實驗室，浙江 杭州 310008

DNA去甲基化酶（dMTase）是主動去甲基化過程中具有糖基化酶和脫嘌呤裂合酶活性的雙功能酶?；诓铇浠蚪M數(shù)據(jù)，本研究利用生物信息學(xué)方法對茶樹DNA去甲基化酶（）編碼基因進(jìn)行了全面鑒定和序列分析。全基因組鑒定結(jié)果表明，舒茶早基因組中包含4個，系統(tǒng)進(jìn)化分析將分為和兩個分支，基因結(jié)構(gòu)分析顯示不同成員之間的基因序列長度和內(nèi)含子數(shù)量存在差異。不同蛋白的理化性質(zhì)相似，均包含ENDO3c和RRM_DME典型的保守結(jié)構(gòu)域，且都定位在細(xì)胞核中。家族基因啟動子區(qū)域包含大量光信號響應(yīng)、植物激素響應(yīng)、脅迫響應(yīng)和生長發(fā)育等相關(guān)順式作用元件。表達(dá)分析結(jié)果顯示，e基因在不同組織器官中均有表達(dá)，有一定的組織特異性；在炭疽菌（）、擬盤多毛孢菌（）和茶尺蠖（）等生物脅迫及干旱等非生物脅迫下，的表達(dá)均被顯著誘導(dǎo)；冬季休眠過程中在不同品種成熟葉和越冬芽中的表達(dá)模式存在顯著差異；在花芽發(fā)育及種子萌發(fā)的不同階段的表達(dá)存在顯著上調(diào)過程。CsdMTases介導(dǎo)的主動去甲基化過程在調(diào)控茶樹脅迫應(yīng)答和生長發(fā)育中可能發(fā)揮了重要的作用，為深入揭示茶樹表觀調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。

茶樹；DNA去甲基化酶；逆境脅迫響應(yīng)；生長發(fā)育；表達(dá)分析

DNA甲基化是表觀遺傳調(diào)控的重要機(jī)制之一，在調(diào)控基因表達(dá)、基因印記、轉(zhuǎn)座子沉默以及維持基因組穩(wěn)定性中發(fā)揮重要作用。在植物中，DNA甲基化主要通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將S-腺苷甲硫氨酸（-adenosyl methionine，SAM）的甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到胞嘧啶的第5位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5-meC）[1]。依據(jù)甲基化的過程，可以大致分為2種類型：（1）從頭合成甲基化，即兩條鏈均未被甲基化的DNA被甲基化；（2）維持甲基化，以甲基化的DNA單鏈為模板，通過DNA復(fù)制對新生鏈進(jìn)行甲基化修飾。依據(jù)甲基化的堿基位點(diǎn)，可以將其分為3種類型：CG、CHG、CHH（H指A、C或T）。在植物中，CG位點(diǎn)的甲基化由甲基轉(zhuǎn)移酶（Methyltransferase 1，MET1）維持[1]；對稱的CHG的甲基化主要由染色質(zhì)甲基化酶（Chromomethylase 3，CMT3）與組蛋白抑制標(biāo)記結(jié)合對未甲基化的CHG進(jìn)行修飾[1]；而非對稱的CHH的甲基化的建立主要通過RNA介導(dǎo)的從頭合成途徑（RNA-directed DNA methylation，RdDM）完成[2]。典型的RdDM包含3個主要的步驟：RNA聚合酶Ⅳ的轉(zhuǎn)錄，從頭合成的DNA甲基化和異染色質(zhì)的形成[3]。植物中3種類型的甲基化均會引起植物整體DNA甲基化水平的升高?；蚪M中DNA甲基化的水平不僅取決于DNA甲基化的建立與維持，也取決于DNA去甲基化的發(fā)生。DNA去甲基化是DNA甲基化的相反過程，即5-甲基胞嘧啶被未修飾的胞嘧啶替代的過程。在植物中，DNA去甲基化可以分為2類，一類是被動的去甲基化，是由于DNA復(fù)制過程中甲基轉(zhuǎn)移酶活性的喪失或甲基供體的缺乏導(dǎo)致甲基化無法維持，從而使整個基因組DNA甲基化水平降低[4]；另一類是主動的去甲基化，即不依賴DNA復(fù)制，由一系列酶催化的酶促反應(yīng)過程。與DNA甲基化不同的是，去甲基化的完成需要包含DNA糖基化酶/裂合酶（DNA glycosylase/lysase）在內(nèi)的一系列酶的催化，而不是單一的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶。在植物DNA主動去甲基化過程中，DNA糖基化酶/裂合酶可以識別并直接去除5-meC。DNA糖基化酶通過特異性裂解N-糖基鍵切除5-meC[5]，從而啟動堿基切除修復(fù)機(jī)制。隨后，裂合酶對DNA進(jìn)行切割，產(chǎn)生缺乏核苷酸的位點(diǎn)，并在切口處產(chǎn)生3′-羥基，DNA聚合酶向其添加未甲基化的胞嘧啶，DNA連接酶通過密封切口來完成修復(fù)過程。因此，基因組DNA甲基化的總體水平受DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和DNA去甲基化酶（DNA demethylase，dMTase）的共同作用。

dMTase是主動去甲基化過程中具有糖基化酶和脫嘌呤裂合酶活性的雙功能酶，含有1個具有DNA結(jié)合活性的典型的雙螺旋發(fā)卡結(jié)構(gòu)，主要負(fù)責(zé)識別并移除5-mC堿基、裂解DNA骨架，以便未甲基化胞嘧啶的添加。植物5-meC DNA糖基化酶歸屬DEMETER-LIKE（DML）家族，是分子量最大、功能最豐富的DNA糖基化酶。在擬南芥中已鑒定的去甲基化酶有ROS1（Repressor of silence 1），DME（Transcriptional activator demeter），DML2（Demeter-like protein 2）和DML3（Demeter-like protein 3），4個dMTase均歸屬DNA糖基化酶家族，除包含1個典型的由HhH-GPD（Helix–hairpin–helix and a Gly/Pro rich loop）組成的具有催化活性的糖基化酶結(jié)構(gòu)域外，還在氮端含有1個短的富含亮氨酸的結(jié)構(gòu)域以及碳端含有1個對催化活性必不可少的大結(jié)構(gòu)域[6]。研究表明，DME可以激活被甲基化沉默的印跡基因的母體表達(dá)，對擬南芥胚乳建立基因組印跡至關(guān)重要[7]。ROS1可以通過去甲基化目標(biāo)DNA啟動子來抑制同源依賴的轉(zhuǎn)錄基因沉默，是釋放高甲基化轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄沉默所必需的糖基化酶[8]。DML2和DML3可以通過去除基因5′和3′甲基化，從而保護(hù)內(nèi)源基因免受潛在的甲基化危害[5]。在其他植物中，已鑒定番茄（）中含有基因3個[9]，水稻（）中6個[10]，楊樹（）中5個[11]。盡管在上述植物中基因已得到廣泛分析和鑒定，但是的保守性及多態(tài)性顯示不同植物、不同物種中的數(shù)量和功能都存在很大差異，而相對于模式草本植物而言，對多年生木本植物中家族基因的研究還有待深入。

茶樹是多年生木本經(jīng)濟(jì)作物，分布地域廣，生長周期中會遇到低溫、干旱、病蟲害等生物和非生物逆境。茶樹在冷馴化階段，其基因組伴隨著DNA甲基化水平的變化，表明DNA甲基化參與茶樹的冷馴化過程，與茶樹的抗寒性息息相關(guān)[12]。DNA甲基化酶和基因在干旱脅迫過程中相對表達(dá)量呈現(xiàn)顯著變化[13]。當(dāng)前有關(guān)茶樹DNA去甲基化酶（）的研究還不夠深入，在茶樹的生長發(fā)育以及生物脅迫調(diào)控中的作用尚不清楚。因此，本研究以公布的小葉種茶樹舒茶早基因組為參考，對茶樹家族基因進(jìn)行了全面的鑒定。結(jié)合表達(dá)分析，以期揭示在茶樹生長發(fā)育（開花、種子萌發(fā)、芽休眠形成及解除）和逆境脅迫，如炭疽菌（）、擬盤多毛孢菌()、茶尺蠖（）和干旱中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

以種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所試驗茶園的20年生茶樹舒茶早、龍井43和碧云為試驗材料，分別采取茶樹的幼嫩葉片和頂芽用于的鑒定。

以種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所試驗茶園的20年生茶樹早生品種龍井43，中生品種碧云，晚生品種政和大白為試驗材料，從2018年9月下旬茶樹進(jìn)入休眠期開始至翌年休眠解除止，依據(jù)芽的發(fā)育和天氣情況于茶樹休眠形成階段、深休眠階段和萌發(fā)階段采摘剪口下第一腋芽和成熟葉，用于茶樹芽和葉休眠形成及解除階段的表達(dá)分析。

以龍井43為試驗材料，采取自然生長條件下茶樹的根、莖、葉、頂芽、腋芽、花蕾和盛花用于組織特異性表達(dá)分析；參照熊飛等[14]所述的生物脅迫取樣方法，以未接種茶樹為對照，給茶樹分別接種炭疽菌、擬盤多毛孢菌、茶尺蠖處理，于12?h和24?h采取接種后的葉片用于茶樹生物脅迫下的表達(dá)分析；于2019年11月上旬采取茶樹不同階段的花用于花芽發(fā)育階段基因表達(dá)分析，同時采回種子用于茶樹種子萌發(fā)過程的表達(dá)分析，處理方法為將種子均分為兩份，一份作為萌發(fā)前基因表達(dá)量測定，另一份扒掉種皮后埋于珍珠巖中萌發(fā)，待胚根長至1~2?cm時拔出洗凈用于萌發(fā)后基因表達(dá)量測定。干旱脅迫取樣以盆栽龍井43為材料，人工氣候室正常培養(yǎng)（25℃，12?h光照/12?h黑暗，濕度65%），對照組正常澆水，處理組不澆水，處理18?d；每隔3?d取樣1次，每次采取每盆的第2~3片葉子，用于基因表達(dá)分析。每次采樣完畢對照組澆水。以上取樣及處理均設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)，取樣后立即放入液氮，置于–80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 家族基因鑒定

從擬南芥信息資源數(shù)據(jù)庫（https://www.arabidopsis）下載擬南芥中已知的dMTase基因序列，并利用這些序列從茶樹參考基因組[15-17]中通過Blast同源比對得到茶樹舒茶早中的基因。為了進(jìn)一步驗證這些序列在茶樹中的準(zhǔn)確性，利用Pfam數(shù)據(jù)庫31.0中的隱式馬爾可夫模型（HMM）搜索，進(jìn)一步驗證了dMTase中兩個特征結(jié)構(gòu)域的存在。然后，檢索已鑒定成員的基因組，轉(zhuǎn)錄本，編碼序列和蛋白序列，利用ProtParam分析程序預(yù)測蛋白分子量、等電點(diǎn)、氨基酸組分等。之后，設(shè)計熒光定量引物用于基因短片段的克隆驗證，PCR產(chǎn)物送至杭州有康生物科技有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果與原序列進(jìn)行比對。

1.3 基因序列、結(jié)構(gòu)比較分析

為了進(jìn)一步了解茶樹基因結(jié)構(gòu)特征，從Phytozome（www.phytozome.net），NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）和JGI（www.jgi.doe.gov）網(wǎng)站下載5種植物（水稻、玉米、葡萄、楊樹、擬南芥）的dMTase蛋白序列。利用clustalw進(jìn)行多序列比對，采用鄰接法利用MEGA 7.0進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。利用SMART對CsdMTase進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析。使用Tbtools軟件對基因的進(jìn)化樹和保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。利用Gene Structure Display Server 2.0（GSDS）進(jìn)行基因內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)分析。為了分析啟動子的順式作用元件，從茶樹基因組數(shù)據(jù)集中檢索起始密碼子的上游序列（2?000?bp），利用Plant CARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html）工具分析啟動子順式作用元件。分析結(jié)果使用Tbtools軟件進(jìn)行可視化。

1.4 核酸提取及表達(dá)分析

1.4.1 總RNA的提取及cDNA的合成

以龍井43、碧云、政和大白不同休眠階段的越冬芽、成熟葉，龍井43、碧云和舒茶早幼嫩葉片，龍井43不同開花階段的花、不同萌發(fā)狀態(tài)的種子、干旱脅迫處理的葉片、生物脅迫處理的葉片為材料，按照CTAB法提取不同處理樣品的總RNA，用NanoDrop ND2000 微量核酸蛋白測定儀測定RNA濃度，1%變性瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量，參照PrimeScript?RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒[Takara，寶生物工程（大連）有限公司]說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA用于基因表達(dá)分析。

1.4.2 基因表達(dá)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 CsdMTase家族基因鑒定及理化分析

基于同源分析，從舒茶早基因組中鑒定出4個基因（CSS0047502.1、TEA031023.1、TEA022110.1、TEA033283.1），經(jīng)過NCBI-blast與其他物種dMTase蛋白序列比對，將4個基因分別命名為和基因（表2）。對鑒定出的基因進(jìn)行了基本特征分析發(fā)現(xiàn)，基因編碼的氨基酸數(shù)目從1?800至1?943個不等，平均長度約為1?865個氨基酸；預(yù)測分子量為200.66~216.76?kDa，平均分子量約為208.49?kDa；理論pI為6.37至8.03，除CsDMEa外，其他蛋白的pI均小于7.0，為酸性蛋白；蛋白不穩(wěn)定系數(shù)均大于40，表明茶樹中CsdMTase蛋白不穩(wěn)定。親水性（GRAVY）分析顯示茶樹中所有的CsdMTase蛋白都是親水性蛋白。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，CsdMTase蛋白均定位于細(xì)胞核中（表2）。

以茶樹舒茶早、龍井43和碧云的cDNA為模板，用表1列出的熒光定量引物為模板，對茶樹基因片段進(jìn)行克隆，結(jié)果如圖1所示，在3個茶樹品種中均有條帶，測序結(jié)果顯示克隆得到基因片段與舒茶早基因序列一致，表明文中鑒定到的4個基因確實存在于茶樹中。

2.2 CsdMTase家族基因的遺傳發(fā)育樹及保守結(jié)構(gòu)域

為探究茶樹基因家族的進(jìn)化關(guān)系，本研究利用擬南芥、葡萄、楊樹、水稻和茶樹的CsdMTase蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明，植物中的基因可以分為和兩個分支。類基因存在于所有雙子葉植物中，但在單子葉植物中不存在（圖2）。葡萄和擬南芥都只有1個基因，而茶樹和楊樹中基因卻有2個。雖然基因存在于所有研究的植物中，但基因的個數(shù)在各個植物中不盡相同（1~6個），其中水稻中最多，為6個。

利用SMART對dMTase進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析（圖2），結(jié)果表明，大多數(shù)dMTase基本包含4個共同保守結(jié)構(gòu)域：ENCO3c結(jié)構(gòu)域（ENCO3C domain，包含HhH-GPD domain），Perm-CXXC結(jié)構(gòu)域（Permuted single zf-CXXC unit，Perm-CXXC domain），RRM_DME結(jié)構(gòu)域（RR DME domain）以及FES結(jié)構(gòu)域（FES domain）。前人對擬南芥的研究表明ENCO3c結(jié)構(gòu)域行使糖苷酶功能，Perm-CXXC結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)DNA 結(jié)合活性[18]。Perm-CXXC結(jié)構(gòu)域和RRM_DME結(jié)構(gòu)域是dMTase特異性結(jié)構(gòu)域，這兩者與ENCO3c結(jié)構(gòu)域共同參與dMTase活性。因此，在我們的分析中，編碼由ENCO3c結(jié)構(gòu)域和DME結(jié)構(gòu)域組成的蛋白質(zhì)的茶樹基因被鑒定為。在茶樹中，所有的均含有ENCO3c、RRM_DME和Perm-CXXC等3個結(jié)構(gòu)域。與ROS分支相比，DME分支的序列保守性更強(qiáng)（圖2）。

表1 茶樹CsdMTases基因家族實時熒光定量引物

表2 茶樹CsdMTases基因的基本特征

注：*是參考Wei等人[16]基因組；**是參考Xia等人[15]基因組

Note: * refers to the genome of Wei et al[16]. ** refers to the genome of Xia et al[15]

2.3 CsdMTase家族基因的結(jié)構(gòu)及啟動子分析

為進(jìn)一步闡明茶樹基因的結(jié)構(gòu)特征，利用GSDS 2.0研究基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，分析顯示基因包含15~19個外顯子（圖3-A）。其中，基因外顯子數(shù)量最多，包含19個外顯子，而和中都只含有15個外顯子。的基因長度和的相似，都含有17個外顯子。

利用Plant CARE數(shù)據(jù)庫對基因上游2?000?bp順勢作用調(diào)控元件分析顯示，基因上游含有大量順式作用元件，大致可以分為4類：光響應(yīng)、植物激素響應(yīng)、脅迫響應(yīng)以及植物生長發(fā)育相關(guān)的作用元件。其中，激素反應(yīng)元件ABRE參與脫落酸反應(yīng)，CGTCA-motif和TGACG-motif涉及茉莉酸甲酯響應(yīng)，GARE-motif和P-box參與赤霉素響應(yīng)，TCA-element參與水楊酸適應(yīng)以及AuxRR-core和TGA-box參與生長素響應(yīng)。啟動子還具有多種應(yīng)激反應(yīng)調(diào)控元件，如參與低溫應(yīng)激的LTR，參與干旱誘導(dǎo)的MBS，涉及防御和應(yīng)激反應(yīng)的TC-rich repeats以及響應(yīng)厭氧誘導(dǎo)的ARE調(diào)控元件。另外，還確定了一些組織特異性的順式調(diào)控元件，例如參與種子特異性調(diào)控的RY-element、胚乳特異性表達(dá)所需的GCN4_motif以及與分生組織特異性激活有關(guān)的CAT-box。除此之外，還發(fā)現(xiàn)中含有參與玉米蛋白代謝調(diào)控的O2-site和與MYBHv1結(jié)合位點(diǎn)有關(guān)的CCAAT-box調(diào)控元件等。

總而言之，茶樹中最常見的順式調(diào)節(jié)元件主要與生理過程有關(guān)，例如光信號、脅迫應(yīng)答和激素響應(yīng)。茶樹中多種順式作用原件的存在表明基因可以參與茶樹的生長發(fā)育以及脅迫應(yīng)答。

2.4 CsdMTase的組織特異性分析

利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測了在茶樹龍井43的組織特異性表達(dá)。結(jié)果顯示（圖4），在花蕾、腋芽、莖中表達(dá)量較高，根中表達(dá)較低；在腋芽和根中表達(dá)差異顯著；在不同組織的表達(dá)模式也不同，在花蕾中表達(dá)量最高，在腋芽和莖中的表達(dá)量較高，盛花、根和葉中的表達(dá)量較低。在花蕾和腋芽中的表達(dá)量較高，在盛花中基本不表達(dá)，而在其他組織均只有微弱的表達(dá)。

圖1 茶樹CsdMTases基因的鑒定

圖2 CsdMTase進(jìn)化樹和保守結(jié)構(gòu)域分析

2.5 CsdMTase在生物和非生物脅迫下的表達(dá)分析

為探究茶樹在響應(yīng)生物脅迫和非生物脅迫下的潛在作用，用實時熒光定量PCR技術(shù)分析了其在炭疽菌、擬盤多毛孢菌和茶尺蠖接種處理以及干旱、休眠誘導(dǎo)條件下的表達(dá)。茶樹在接種炭疽菌處理12?h后，基因的所有成員表達(dá)量都達(dá)到最大值，并且與接種前相比均存在顯著性差異，隨后表達(dá)下調(diào)，至24?h時，、和的表達(dá)量仍較未處理前的高（圖5），而和未處理前趨于一致（圖5）。茶樹在接種茶尺蠖處理時，除是在接種24?h才有顯著性升高外，基因的表達(dá)模式也跟接種炭疽菌的一致。當(dāng)給茶樹接種擬盤多毛孢菌時，基因的表達(dá)模式與前兩者有所差別。在接種擬盤多毛孢菌后，除外，基因的表達(dá)量持續(xù)上升，并且在24?h時達(dá)到最大。表明茶樹受到生物脅迫時短期內(nèi)能夠誘導(dǎo)基因表達(dá)，該結(jié)果也和基因啟動子包含與脅迫應(yīng)激響應(yīng)的順式作用原件一致。

注：（A）茶樹CsdMTase基因的內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)；（B）茶樹CsdMTase啟動子順式調(diào)控元件

在干旱脅迫下，基因的所有成員都顯示出轉(zhuǎn)錄表達(dá)量的顯著變化（圖6）。隨著干旱處理時間的延長，基因的相對表達(dá)量也相應(yīng)增加，除了外，基因的其余成員均在干旱處理12?d時相對表達(dá)量達(dá)到最大，并且與干旱處理0?d時有顯著性差異。在干旱處理3?d時相對表達(dá)量有所增加，隨著干旱處理時間的延長，基因的相對表達(dá)量下調(diào)，在12?d時又有所增加，并且在18?d時達(dá)到最大，表明基因可能在干旱脅迫過程中起到調(diào)控作用（圖6）。

2.6 CsdMTase在生長發(fā)育過程中的表達(dá)分析

為探究在茶樹生長發(fā)育中的可能調(diào)控作用，利用qRT-PCR技術(shù)分析了基因在不同萌發(fā)物候型茶樹品種從秋季茶樹頂芽開始停止生長到春季萌發(fā)期間以及茶樹龍井43花芽發(fā)育階段和種子萌發(fā)過程的表達(dá)量變化。如圖7所示，在茶樹芽休眠形成階段，在茶樹早生品種龍井43（除外）、中生品種碧云以及晚生品種政和大白芽中的表達(dá)量均達(dá)到最大值；在深休眠階段，表達(dá)下調(diào)，并達(dá)到最低；而在萌發(fā)階段，表達(dá)上調(diào)，但是仍然低于休眠形成階段的水平。在萌發(fā)階段，3個品種的表達(dá)量有所差異，可能是由于3個品種休眠解除時間的不同導(dǎo)致。在不同萌發(fā)物候期茶樹品種芽中的表達(dá)量存在差異，并且龍井43>碧云>政和大白。其原因可能是此時龍井43已經(jīng)萌發(fā)，生長較活躍；而碧云可能處于萌動階段，政和大白則可能處于休眠后期。由此可見，茶樹在芽停止生長開始到芽萌動階段的表達(dá)模式與冬季芽休眠形成及解除高度關(guān)聯(lián)。

茶樹在母葉中的表達(dá)模式（圖7-D—F）跟在芽中的有一定差別。在早生品種茶樹龍井43葉片中，、有著相同的表達(dá)模式，即在休眠形成階段，表達(dá)量處于較低水平，在萌芽階段表達(dá)量達(dá)到最大，而是在深休眠階段表達(dá)量最高，萌芽階段表達(dá)量最低，則與相反，在深休眠階段表達(dá)量達(dá)到最低，萌發(fā)階段表達(dá)顯著回升；在茶樹中生品種碧云和晚生品種政和大白中，也在休眠形成階段表達(dá)量最低。結(jié)果表明基因在不同萌發(fā)物候型茶樹芽休眠形成和解除階段過程中，在芽和母葉中的表達(dá)模式不同，對茶樹的調(diào)控作用可能不同。

注：圖中不同字母表示0.05水平上差異顯著

利用qRT-PCR技術(shù)分析了基因在花芽發(fā)育階段和種子萌發(fā)過程的表達(dá)量變化。由圖8可以看出，在花芽發(fā)育階段，在露白期表達(dá)顯著上調(diào)，和在開放期顯著下調(diào)。在花芽發(fā)育階段的顯著變化表明其在花的發(fā)育中起到調(diào)控作用。

注：圖中不同字母表示0.05水平上差異顯著

Note: Different letters in the figure indicate significant differences at the level of 0.05

Fig. 6 Expression analysis ofunder drought stress in Longjing 43

注：（A）和（D）為茶樹品種龍井43；（B）和（E）為茶樹品種碧云；（C）和（F）為茶樹品種政和大白。I：2018年10月25日（茶樹休眠形成階段）；Ⅱ：2019年1月14日（茶樹深休眠階段）；Ⅲ：2019年3月13日（茶樹休眠解除階段）。圖中紅色和藍(lán)色分別表示較高和較低的表達(dá)水平（與白色相比）

Note: (A) and (D) Tea plant variety Longjing 43. (B) and (E) Tea plant variety Biyun. (C) and (F) Tea plant variety Zheng he da bai. I: October 25, 2018 (Paradormancy stage of tea plants). Ⅱ: January 14, 2019 (Endodormancy stage of tea plants). Ⅲ: March 13, 2019 (Encodormancy stage of tea plants). Compared with the white color, the red and blue colors in the graph indicate higher and lower expression levels, respectively

圖7 茶樹基因在不同茶樹品種芽和葉休眠誘導(dǎo)下的表達(dá)分析

Fig. 7 Expression analysis ofin buds and leaves of different tea cultivars at different dormancy periods

在種子萌發(fā)前后也發(fā)生顯著變化，在萌發(fā)種子中的表達(dá)量顯著高于未萌發(fā)種子，約為萌發(fā)前的19倍；而在萌發(fā)種子中表達(dá)顯著下調(diào)，表明和可能參與胚乳的表達(dá)調(diào)控，在種子萌發(fā)過程中起作用。

3 討論

3.1 dMTases的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征

DNA甲基化是影響許多生物學(xué)過程的重要表觀遺傳修飾，不僅參與基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，而且還參與維持基因組的穩(wěn)定性。dMTase可以去除甲基化并調(diào)節(jié)基因表達(dá)，與植物抗逆性密切相關(guān)，在表觀遺傳學(xué)中起著重要作用。目前，已在多種植物中進(jìn)行了基因的鑒定，如擬南芥[21]、番茄[9]、蓖麻[22]、草莓[23]、花生[24]、棉花[25]等植物。本研究從茶樹舒茶早中鑒定了4條基因，其具有已報道的植物的典型特征。系統(tǒng)進(jìn)化分析將鑒定出的4個基因分成和兩個分支，發(fā)現(xiàn)茶樹的與葡萄和楊樹的親緣關(guān)系更密切；Gu等[21]將草莓中基因家族的4個基因歸為兩個分支，DME類基因存在于所有的雙子葉植物中，在單子葉植物中不存在，且發(fā)現(xiàn)其在環(huán)境脅迫（鹽、干旱、低溫、高溫）和草莓果實生長中具有調(diào)節(jié)作用。Cao等[9]將番茄中基因家族的3個基因歸為2個分支，并發(fā)現(xiàn)其參與果實成熟的調(diào)控?；蚪Y(jié)構(gòu)及保守結(jié)構(gòu)域分析表明，茶樹基因家族聚類關(guān)系較近的基因具有相似的基因結(jié)構(gòu)，如分支的和含有相同外顯子數(shù)目。同時保守結(jié)構(gòu)域的個數(shù)和種類具有一定相似性，在氮端都含有ENDO3c結(jié)構(gòu)域，在碳端都含有DME結(jié)構(gòu)域，這與葡萄、水稻、楊樹的dMTase蛋白保守結(jié)構(gòu)完全一致（圖1）。說明這兩個結(jié)構(gòu)域是dMTase高度保守的結(jié)構(gòu)域，編碼由這兩個結(jié)構(gòu)域組成的蛋白質(zhì)的基因可以被鑒定為推定的基因。

為了確定茶樹中特定表觀遺傳基因可調(diào)控轉(zhuǎn)錄的因素，分析了它們在基因上游2?000?bp內(nèi)推定的順式作用元件的啟動子序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，的啟動子大致具有光響應(yīng)、植物激素響應(yīng)、脅迫響應(yīng)和生長發(fā)育4類順式作用調(diào)控元件，其中脅迫響應(yīng)類作用元件主要涉及低溫應(yīng)激、干旱誘導(dǎo)以及防御和應(yīng)激反應(yīng)，而生長發(fā)育相關(guān)的作用原件主要與種子特異性調(diào)控和胚乳特異性表達(dá)相關(guān)。

3.2 CsdMTase基因的表達(dá)與逆境脅迫的關(guān)系

在擬南芥中，轉(zhuǎn)座因子序列（Transposable element sequences，TE）的DNA去甲基化（主要由ROS1完成）可以促進(jìn)防御相關(guān)基因的表達(dá)，介導(dǎo)的啟動子轉(zhuǎn)座因子的DNA去甲基化對于防御相關(guān)基因表達(dá)的激活至關(guān)重要，并且dMTase調(diào)控的鐮刀菌脅迫應(yīng)答相關(guān)的基因表達(dá)具有組織特異性[28]；茶樹在接種炭疽菌、茶尺蠖和擬盤多毛孢菌處理的短時間內(nèi)，基因的表達(dá)水平發(fā)生顯著變化，基因相對表達(dá)量迅速增大，表明受生物脅迫的顯著誘導(dǎo)，茶樹通過DNA甲基化機(jī)制快速響應(yīng)生物脅迫。目前，植物中dMTase對生物脅迫調(diào)節(jié)作用的相關(guān)研究還很缺乏，該結(jié)果可為日后dMTase對生物脅迫的調(diào)控作用提供依據(jù)。此外，在各種非生物脅迫下，基因的表達(dá)水平也發(fā)生了顯著變化，這表明某些關(guān)鍵基因的去甲基化可能對植物中的非生物反應(yīng)至關(guān)重要。油菜中，和在鹽脅迫和高溫脅迫下均溫和上調(diào)，，和表現(xiàn)出對鹽脅迫的一些下調(diào)響應(yīng)，而在熱脅迫下較少表達(dá)[27]；蓖麻在干旱脅迫下基因顯著上調(diào)；茶樹在干旱脅迫時基因的表達(dá)水平也顯著升高，尤其是基因的表達(dá)水平最高[13]。

注：（A）CsdMTases在茶樹花芽發(fā)育過程的表達(dá)分析，S：幼蕾期，M：露白期，L：開放期。（B）CsdMTases在茶樹種子萌發(fā)過程的表達(dá)分析，I：成熟種子，Ⅱ：萌發(fā)種子。圖中不同小寫字母表示0.05水平上差異顯著；*表示P<0.05；**表示P<0.01

3.3 CsdMTase基因的表達(dá)與生長發(fā)育的關(guān)系

研究顯示，在擬南芥中，幼嫩和成年擬南芥組織中的，和基因表達(dá)量增加[21]；在楊樹中，過表達(dá)會促進(jìn)楊樹的頂芽提前形成[11]，而的沉默會導(dǎo)致楊樹的芽萌發(fā)推遲[28]，說明DNA去甲基化作用可調(diào)控芽的生長發(fā)育；在蓖麻中，在種子發(fā)育階段顯著上調(diào)[22]，表明其可能在種子發(fā)育中具有潛在作用。在茶樹中，基因在茶樹種子萌發(fā)、花芽發(fā)育階段顯著上調(diào)，表明茶樹可能在胚乳形成中起調(diào)節(jié)作用，并且通過參與的DNA去甲基化作用調(diào)控茶樹的生長發(fā)育。在茶樹休眠形成及解除階段，基因在不同品種以及葉、芽中表達(dá)水平差異也很大，在茶樹早生品種、中生品種、晚生品種中生理休眠期顯著下調(diào)，而在生態(tài)休眠期表達(dá)量又有所上升，但是表達(dá)量依舊沒有類休眠期的高，表明基因可能在茶樹芽休眠的形成和解除過程中發(fā)揮著重要的作用。

DNA甲基化對于調(diào)節(jié)植物的發(fā)育和對環(huán)境脅迫應(yīng)答至關(guān)重要，但是DNA甲基化酶和dMTase如何參與各種反應(yīng)是一個復(fù)雜的過程，其機(jī)制仍不清楚?；虻牟町惐磉_(dá)分析表明，在不同逆境脅迫下，基因的表達(dá)水平發(fā)生了很大變化，一些關(guān)鍵基因可能被去甲基化。因此，DNA甲基化最有可能參與環(huán)境對茶樹生長發(fā)育的影響。本研究為茶樹中DNA甲基化對脅迫響應(yīng)及其在種子萌發(fā)和花芽發(fā)育中的調(diào)控作用提供了一些線索，并為進(jìn)一步探索茶樹逆境脅迫以及生長發(fā)育過程中的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制提供了基礎(chǔ)。

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Genome-wide Investigation and Expression Analysis of DNA Demethylase Genes in Tea Plant ()

CHEN Yao, ZHANG Weifu, REN Hengze, XIONG Fei, ZHANG Haojie, YAO Lina, LIU ying, WANG Lu, WANG Xinchao, YANG Yajun*, HAO Xinyuan*

Tea Research Institute of the Chinese Agriculture Science/National Center for Tea Improvement/Key Laboratory of Tea Biology and Resources Utilization, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Hangzhou 310008, China

DNA demethylase (dMTase) is a bifunctional enzyme with activities of glycosylase and apyrimidic lysase during active demethylation. Based on the available genome data of tea plant, bioinformatics analysis was used to comprehensively identify DNA demethylases () in tea plant. The genome-wide identification results show that the tea cultivar Shuchazao contains 4. Thesecould be divided into two branches (and) with differences in gene length and intron number by phylogenetic and gene structure analysis. Further analysis shows that the physical and chemical properties of different CsdMTase proteins are similar, which contain the typical conserved domains of ENCO3c and RRM_DME and are located in the nucleus. The promoter regions ofcontain a large number of-acting components related to light response, plant hormone response, stress response and growth and development. Thegenes are expressed in all detected tissues with certain tissue specificity. The expressions ofwere significantly up-regulated under biotic stresses, including,andtreatments. During winter dormancy, different expression patterns ofwere detected in mature leaves and overwintering buds of different cultivars. The expressions ofandat different stages of flower bud development and seed germination were significantly induced. The results show that active DNA demethylation process mediated byplays a crucial role in regulating the stress responses, growth and development of tea plant, providing a theoretical basis for discovering the epigenetic regulation mechanism in tea plant.

tea plant, DNA demethylase, stress response, growth and development, expression analysis

S571.1；Q523

A

1000-369X(2021)01-028-12

2020-05-27

2020-06-17

國家自然科學(xué)基金（31972461）

陳瑤，女，碩士研究生，主要從事茶樹遺傳育種研究。*通信作者：yjyang@tricaas.com，haoxy@tricaas.com

（責(zé)任編輯：趙鋒）