鄧 瀟,陳 宇,馬仲煉,黃先敏
(昭通學(xué)院農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,云南昭通,657000)
蘋果早期落葉病是指蘋果樹在生長季節(jié)非正常大量落葉病害的統(tǒng)稱[1]。早期落葉病是昭通蘋果產(chǎn)區(qū)的主要病害,發(fā)病普遍,危害嚴(yán)重[2]。據(jù)報(bào)道,早期落葉病有蘋果斑點(diǎn)落葉病、褐斑病、灰斑病及圓斑病4種類型。早期落葉病影響幼樹適齡結(jié)果及早期生產(chǎn),削弱樹勢、降低果實(shí)產(chǎn)量及品質(zhì)等[3]。斑點(diǎn)落葉病是由蘋果鏈格孢菌(AlternariamaliRoberts)引起,病原菌屬半知菌亞門真菌,侵染蘋果葉片,引起早期落葉病[4]。斑點(diǎn)落葉病葉上病斑近圓形,灰褐色,有輪紋,上生子實(shí)體[5]。蘋果褐斑病是由蘋果盤二孢菌(Marssoninamali)引起,病斑近圓形,褐色或紫褐色,邊緣不明顯,造成樹葉早落[6]。蘋果灰斑病由梨葉點(diǎn)霉菌(PhyllostictapyrinaSacc.)引起[7-8],葉片上形成黃色至灰色的病斑,在成熟的葉片上多呈近圓形壞死斑,病斑上散生的黑色小點(diǎn),是病菌的分生孢子器[9-10]。蘋果圓斑病是一種高等真菌性病害,由孤生葉點(diǎn)霉(Phyllostictasolitaria)引起,葉片受害形成褐色圓斑[11-12]。
至今報(bào)道,引起蘋果早期落葉病的病原菌有:蘋果盤二孢菌、蘋果鏈格孢菌、梨葉點(diǎn)霉菌及孤生葉點(diǎn)霉菌4種病原菌。除去這4種病原菌,還未曾見有過其他引起早期落葉病病原菌的報(bào)道。2019年10月,作者在云南省昭通市舊圃鎮(zhèn)大村的一個(gè)蘋果園中,發(fā)現(xiàn)了該園中的許多蘋果樹感染了早期落葉病。采集其中感病最為嚴(yán)重的4株蘋果樹的病葉帶回實(shí)驗(yàn)室,從中分離純化出一種新的病原菌。本試驗(yàn)從病原菌的分離純化[13]、培養(yǎng)特性、顯微結(jié)構(gòu)觀察[14]及柯赫氏法則進(jìn)行致病性測定[15]等方面,確定所分離純化出的病原菌是蘋果葉部病害上新的病原菌,該試驗(yàn)結(jié)果可為蘋果早期落葉病的防治提供依據(jù)。
蘋果早期落葉病葉采自云南省昭通市舊圃鎮(zhèn)大村蘋果園,果園地處三面環(huán)山的山谷,蘋果品種為紅富士,樹齡24年。選擇園中患病最為嚴(yán)重的4株蘋果樹,每株病樹按東、南、西、北4個(gè)方向采摘病葉,每個(gè)方向采摘病葉6片,共計(jì)96片病葉??潞帐戏▌t進(jìn)行致病性測定所用接種蘋果樹為兩年生盆栽紅富士蘋果樹。
采用常規(guī)組織分離法、稀釋涂布法及劃線純化法,對(duì)蘋果早期落葉病葉中的病原菌進(jìn)行分離和純化。采用插片法制作病原菌涂片,用CX40生物光學(xué)顯微鏡對(duì)病原菌的結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。按照柯赫氏法則進(jìn)行致病性測定。
1.2.1 病原菌的分離純化
將從果園采回的早期蘋果落葉病葉剪碎,稱取剪碎病葉10 g,放入盛90 mL無菌水的三角燒瓶中,用超聲波清洗器振蕩約5 min,使病葉組織中的病原菌充分分離出來,均勻分散在無菌水中。然后在無菌操作臺(tái)內(nèi),用移液器吸取1 mL液體,加入盛有9 mL無菌水的試管中,充分混勻。再用移液器從此試管中吸取1 mL病葉組織液,加入另一盛有9 mL無菌水的試管中,混合均勻。以此類推,制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5不同稀釋濃度的植物病葉組織懸液。
用移液器分別吸取稀釋梯度為10-3、10-4和10-5的蘋果落葉病葉懸液1 mL,放入PDA培養(yǎng)基平板中,每一種稀釋梯度做3個(gè)重復(fù)。再用無菌涂布棒將病葉懸液沿同心圓輕輕地向外擴(kuò)展,涂抹均勻,靜置10 min。然后將平板倒置于溫度28 ℃、濕度80%的人工氣候箱中培養(yǎng)。
經(jīng)過20 h后,PDA平板上長出直徑約2 cm的菌落,挑取單個(gè)菌落,用劃線接種法接種于PDA平板上進(jìn)一步純化培養(yǎng),對(duì)分離得到的菌株,再進(jìn)一步做試管斜面純化,得到純化的病原菌菌株。
1.2.2 病原菌的顯微制片
用插片法對(duì)病原菌進(jìn)行顯微制片,將消毒滅菌后的蓋玻片以45°的斜角插入PDA平板中,再將純化好的病原菌用接種環(huán)刮取病原菌后,接種環(huán)在培養(yǎng)基與蓋玻片的交界處劃線。將平板倒置于溫度28 ℃、濕度80%的人工氣候箱中培養(yǎng)觀察,經(jīng)培養(yǎng)2 d后,菌絲長滿平板,將蓋玻片用無菌鑷子取出,制作臨時(shí)裝片,在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行病原菌的結(jié)構(gòu)觀察。
1.2.3 病原菌接種蘋果葉片
將純化好的病原菌采用柯赫氏法則進(jìn)行回接致病性試驗(yàn)。室外試驗(yàn),時(shí)間是6月的中、下旬,溫度在15~29 ℃,平均相對(duì)濕度在49%~83%。在純化好的病原菌試管中,加入無菌水9 mL后,用接種環(huán)輕輕刮病原菌,制成病原菌懸浮液備用。用75%酒精把2年生盆栽紅富士蘋果樹葉擦拭干凈,再用無菌水沖洗干凈。用無菌接種針在樹葉上扎成直徑約5 mm的傷口,在傷口處涂抹上病原菌懸浮液。每株樹的4個(gè)方向分別選擇6片樹葉做有傷接種,同時(shí)以無菌水用上述同樣的方法接種葉片作為對(duì)照,進(jìn)行觀察比較。
1.2.4 接種病原菌感病葉片中的病原菌
分離純化及顯微觀察
將純化出的病原菌接種蘋果樹葉后,采摘感病葉片參照步驟2.2.1進(jìn)行分離純化;參照步驟2.2.2制作病原菌的顯微圖片。
將純化好的病原菌,接種在PDA培養(yǎng)基上,觀察病原菌在PDA培養(yǎng)基上的生長情況。試驗(yàn)結(jié)果看出,病原菌接種PDA后,經(jīng)過9 h,在PDA平板上長出肉眼可見的淡白色菌落,直徑1 cm。18 h時(shí),培養(yǎng)基上菌落變大,直徑約2 cm,呈白色,長出絨毛狀菌絲。培養(yǎng)基背面無明顯變化。23 h時(shí),菌落直徑3 cm,白色絨毛狀菌絲長約1 mm,接種點(diǎn)處變?yōu)榛疑?,培養(yǎng)基背面中央為白色。26 h時(shí),菌落直徑4 cm,菌落邊緣白色絨毛狀菌絲匍匐于培養(yǎng)基上,寬約1 cm,中央直立菌絲長約2 mm,培養(yǎng)基背面中央白色加深。32 h時(shí),菌絲長滿整個(gè)平板,中央直立菌絲抵達(dá)皿蓋,周圍菌絲較矮,匍匐于培養(yǎng)基上,培養(yǎng)基背面中央白色面積擴(kuò)大。40 h時(shí),菌絲由白色變成淺褐色,培養(yǎng)基背面由白色變成淺灰色。46 h時(shí),菌絲呈現(xiàn)灰色或褐色,培養(yǎng)基背面為灰色或淺黃色(見圖1)。
圖1 病原菌的培養(yǎng)特征(A為正面,B為反面)
采用插片法,使病原菌長在蓋玻片上,做成臨時(shí)裝片。在CX40顯微鏡下進(jìn)行觀察,可得病原菌的顯微結(jié)構(gòu)圖(見圖2)。
從圖2中可以看出,在40倍和100倍顯微鏡下,該病原菌的結(jié)構(gòu)完整,菌絲為無隔膜菌絲,具有假根和匍匐枝,假根相對(duì)處向上長出孢囊梗,2根孢囊梗簇生在一起(圖2-A、B)。在200倍下,孢囊梗單生,不分枝,頂端產(chǎn)生孢子囊。孢子囊球形,囊軸明顯,基部有囊托,內(nèi)有大量孢囊孢子(圖2-C)。在400倍下,孢囊孢子球形、卵形或不規(guī)則形,有棱角,表面有線紋,無色至淡褐色(圖3-D)。
A:40倍顯微鏡下的病原菌結(jié)構(gòu)圖;B:100倍顯微鏡下的病原菌結(jié)構(gòu)圖;C:200倍顯微鏡下的孢囊梗和孢子囊;D:400倍顯微鏡下的孢囊孢子圖2 早期蘋果落葉病葉中分離出的病原菌的顯微結(jié)構(gòu)
根據(jù)柯赫氏法則,將純化的病原菌菌株進(jìn)行回接試驗(yàn),觀察病原菌對(duì)蘋果樹葉的感染情況,以無菌水作為對(duì)照。結(jié)果見圖3。
從圖3中可以看出,病原菌接種到樹葉后,樹葉的感染過程為:在接種初期,樹葉無明顯癥狀,到接種86 h后,接種樹葉出現(xiàn)長度為0.5 cm的不規(guī)則形病斑,病斑為褐色,病、健部分界明顯(圖3-C)。接種96 h后,病斑擴(kuò)大,形狀不規(guī)則,直徑1 cm左右,病斑為褐色,病、健部分界明顯(圖3-D)。接種108 h后,病斑擴(kuò)大至葉面積的1/4,形狀不規(guī)則,病斑中央顏色為紅褐色,邊緣為紫褐色(圖3-E)。接種132 h后,病斑不再擴(kuò)大,病斑直徑2~3 cm,顏色為棕色至褐色,形狀不規(guī)則,邊緣顏色較深,病斑干燥易破裂(圖3-F)。以無菌水做對(duì)照的試驗(yàn)組,從接種無菌水到132 h,在樹葉上均未出現(xiàn)任何癥狀,同時(shí),用接種環(huán)在樹葉上劃的傷口已愈合。
A—B:對(duì)照組,接種0.05 mL無菌水;C—F:試驗(yàn)組,接種0.05 mL病原菌菌懸液圖3 病原菌侵染蘋果葉片癥狀
將從蘋果園中采集的早期落葉病葉中分離、純化的病原菌菌種,轉(zhuǎn)接到蘋果樹葉上,能夠感染蘋果葉片,受感染的樹葉癥狀與田間采回病葉的癥狀一致。
將接種病原菌后感病葉片進(jìn)行組織分離,獲得病原菌。采用插片法使病原菌長在蓋玻片上,制成臨時(shí)裝片,進(jìn)行顯微結(jié)構(gòu)觀察,結(jié)構(gòu)如圖4。
從圖4中可以看出,從轉(zhuǎn)接病原菌葉片中分離出的病原菌結(jié)構(gòu),與從果園中采集病葉中分離的病原菌顯微結(jié)構(gòu)一致。菌絲為無隔菌絲(圖4-B、C),具有假根和匍匐枝(圖4-A),孢囊梗與假根相對(duì)生長。孢囊梗單生,不分枝,頂端產(chǎn)生孢子囊。孢子囊球形,囊軸明顯,基部有囊托,內(nèi)有大量孢囊孢子,孢囊孢子球形、卵形或不規(guī)則形,有棱角。可見,接種后與果園采集的病原菌是同一種病原菌。
A:40倍顯微鏡下病原菌的結(jié)構(gòu)圖;B:100倍顯微鏡下病原菌的結(jié)構(gòu)圖;C:200倍顯微鏡下病原菌的孢囊梗、孢子囊及孢囊孢子圖4 從轉(zhuǎn)接病原菌蘋果葉片上分離出的病原菌顯微結(jié)構(gòu)
本試驗(yàn)從蘋果早期落葉病葉中分離、純化出的病原菌,在PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特性是,28 ℃時(shí),在PDA培養(yǎng)基上快速生長,32 h時(shí)即長滿整個(gè)培養(yǎng)皿,先為白色,后變淺褐色至黑色。反面起先白色,后變成灰白色。匍匐菌絲起先白色,后變褐色。顯微結(jié)構(gòu)為具有假根和匍匐枝,假根分枝多,發(fā)育良好。孢子囊柄直立,不分枝,褐色,2枝簇生,長在假根對(duì)側(cè),菌絲無分隔,細(xì)胞壁平滑。孢子囊球形,囊軸明顯,基部有囊托,內(nèi)有大量孢囊孢子,孢囊孢子數(shù)量多,呈球形、卵形或不規(guī)則形,有棱角,表面有線紋,無色至淡褐色。參照陸家云的《植物病害真菌學(xué)》及陳江華的文獻(xiàn)[5,16],可以確定本試驗(yàn)中,從早期落葉病葉中分離出的病原菌為匍枝根霉菌(Rhizopusstolonifera)。關(guān)于匍枝根霉侵染、危害植物果實(shí)有過報(bào)道[17],而對(duì)植物葉片的侵染危害,還未曾見有過報(bào)道。
報(bào)道引起蘋果早期落葉病的病原菌有:引起斑點(diǎn)落葉病的蘋果鏈格孢菌,引起蘋果褐斑病的蘋果盤二孢菌,引起蘋果灰斑病的梨葉點(diǎn)霉菌和引起蘋果圓斑病的孤生葉點(diǎn)霉。早期落葉病葉中有匍枝根霉病原菌的報(bào)道還未曾見有過。蘋果鏈格孢菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)1 d后,接種點(diǎn)的邊緣有青褐色菌絲長出。培養(yǎng)3 d后,產(chǎn)生大量分生孢子,呈倒梨形、近卵狀,具橫隔,分生孢子鏈細(xì)長。7 d后,長滿培養(yǎng)皿,呈圓形。菌落中央黑色,外部青褐色,邊緣色淺。氣生菌絲較短,可見褐色粉狀物[18]。在PDA 平板上,蘋果盤二孢病菌生長緩慢,菌落近圓形,隆起,黑色至黑褐色,表面不光滑,呈蚯蚓糞狀,無氣生菌絲,邊緣不規(guī)則,觀察不到子實(shí)體和基內(nèi)菌絲。蘋果褐斑病葉葉片變黃易脫落,病、健交界處不明顯[19]。蘋果灰斑病的病原菌為梨葉點(diǎn)霉菌,其分生孢子無色、單胞,內(nèi)含一個(gè)油球,聚集在一起時(shí)呈淡黃色[5]。蘋果圓斑病的病原菌為孤生葉點(diǎn)霉,菌落正面墨綠色或灰白,反面墨綠色,近似圓形,全緣,稠密,中央氣生菌絲發(fā)達(dá),灰色。分生孢子器球形或橢圓形,上端具1孔口,深褐色;分生孢子單胞、無色,橢圓形或卵形,內(nèi)具透明狀油點(diǎn)[6]??梢?,該試驗(yàn)所分離出來的病原菌是與以往不同的一種病原菌。
通過常規(guī)組織分離、柯赫氏法則驗(yàn)證及病原菌的鑒定(培養(yǎng)特性和顯微結(jié)構(gòu)),證實(shí)從蘋果早期落葉病葉中分離出來的病原菌是匍枝根霉菌,匍枝根霉感染蘋果落葉病的報(bào)道未曾見到,這是首次發(fā)現(xiàn)存在蘋果落葉病葉中的病原菌——匍枝根霉,該發(fā)現(xiàn)可為蘋果早期落葉病的防治提供依據(jù)。