黃 露，譚清群，李添瓊，唐靖文，秦智慧，王國立，吳石平

(1 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，貴陽，550009；2 貴州省修文縣農(nóng)業(yè)局，貴州修文，550200；3 貴州省修文縣獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展局，貴州修文，550200)

貴州自1988年起開始種植獼猴桃，目前種植面積已超過3.33萬hm2。修文縣2016年種植面積已達(dá)1.06萬hm2，且在不斷擴(kuò)大，是貴州的獼猴桃主產(chǎn)區(qū)，但近幾年獼猴桃生產(chǎn)上受到病害的制約，其中，危害最大的是獼猴桃潰瘍病。獼猴桃潰瘍病是一種極具毀滅性的細(xì)菌性病害，病原菌為丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種(Pseudomonassyringaepv.actinidiae，Psa)，其為害獼猴桃植株的枝干、葉片及花等部位，造成枝蔓、葉枯死，花蕾萎蔫脫落，果實(shí)干縮、脫落，整株枯死，造成果園大量減產(chǎn)，嚴(yán)重的甚至毀園[1-2]。新西蘭、意大利及我國陜西、四川等地的獼猴桃園，由于潰瘍病的爆發(fā)及流行，短時間內(nèi)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3-5]。由于不同地區(qū)分離到的獼猴桃潰瘍病菌在致病力、抗藥性、生長狀況等生物學(xué)特性上差異較大，因此研究病菌的群體遺傳多樣性具有重要意義。Lee等[6]采用RAPD方法研究發(fā)現(xiàn)，日本及韓國的Psa具有不同的系統(tǒng)發(fā)育起源。Ferrante等[7]利用ERIC-PCR和BOX-PCR分析發(fā)現(xiàn)，意大利的Psa菌株與20世紀(jì)危害嚴(yán)重的Psa菌株表現(xiàn)出不同的指紋圖譜。有研究認(rèn)為，Psa分為4個生物型，Psa1型病菌分布于日本、意大利，Psa2型病菌分布于韓國，Psa3型廣泛分布于歐洲、新西蘭、智利、中國，Psa4型僅在新西蘭和澳大利亞有分布[8-10]。Cunty等[11]通過4個基因(gapA、gltA、gyrB和rpoD)進(jìn)行多樣性分析，發(fā)現(xiàn)Psa1、Psa2和Psa3在基因上有很大的相關(guān)性，且與Pseudomonassyringaepv.theae同源關(guān)系較近，而Psa4則與其同源關(guān)系較遠(yuǎn)。高小寧等[12]通過Rep-PCR分析發(fā)現(xiàn)，陜西省獼猴桃潰瘍病菌基因組存在豐富的遺傳多樣性。目前，貴州修文獼猴桃潰瘍病菌還沒有系統(tǒng)性地進(jìn)行分離鑒定及遺傳多樣性研究。本研究系統(tǒng)地對貴州修文的獼猴桃潰瘍病菌進(jìn)行分離鑒定，并利用ERIC-PCR分析病菌群體的遺傳多樣性，可為病菌檢測、發(fā)生流行規(guī)律研判、抗病種選育和病害防控等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 獼猴桃潰瘍病菌分離材料 2016—2017年，在貴州修文多個貴長獼猴桃果園采集感染潰瘍病的獼猴桃枝條、葉片、花蕾等材料，進(jìn)行潰瘍病菌的分離。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0～7.2，固體培養(yǎng)基則加入15 g/L的瓊脂，121 ℃滅菌20 min，用于獼猴桃潰瘍病菌的分離純化。

1.1.3 引物 細(xì)菌16S rDNA通用引物：27F: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R: 5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’。ERIC引物：ERIC1：5’-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3’，ERIC2：5’-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3’。所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.1.4 試劑和儀器 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；無水乙醇、 異丙醇均為國產(chǎn)分析純等級；凝膠成像儀為Gel Doc-ItTMUVP凝膠成像系統(tǒng)；PCR儀為BIO-RAD。

1.2 方法

1.2.1 獼猴桃潰瘍病菌分離保存 采用平板劃線法進(jìn)行分離。分別取感染潰瘍病的貴長獼猴桃枝條、葉片、花蕾等材料，用75%酒精和2%次氯酸鈉溶液進(jìn)行表面消毒，用滅菌去離子水洗3次，取少量病健交界處的組織轉(zhuǎn)移到含有0.5 mL無菌生理鹽水無菌培養(yǎng)皿中，靜置10～15 min，形成細(xì)菌懸浮液。采用滅菌移植環(huán)蘸取少量懸浮液在LB平板培養(yǎng)基上劃線，28 ℃培養(yǎng)48 h，觀察結(jié)果，并挑取單菌落在LB培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)接純化2～3次后，-80 ℃保存[13]。

1.2.2 獼猴桃潰瘍病菌16s rDNA鑒定 分離到的病菌用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。對提取的樣品DNA進(jìn)行16s rDNA擴(kuò)增測序。PCR反應(yīng)體系(25 μL)包括：9.5 μL ddH2O，12.5 μL PCR Mix，1 μL 27F/1492R引物(10 mmol·L-1)，1 μL模板DNA。PCR循環(huán)參數(shù)為：95 ℃熱變性10 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；最后在4 ℃停止反應(yīng)[14]。采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.2% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并將有條帶的PCR產(chǎn)物送樣測序。將測序結(jié)果進(jìn)行Blast比對，采用BioEdit軟件對從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取的可信度較高的相似序列進(jìn)行多序列比對，然后用MEGA 6.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建和聚類分析。

1.2.3 獼猴桃潰瘍病菌ERIC-PCR多態(tài)性分析 使用Rep-PCR引物ERIC1/ERIC2對分離菌株基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增分析。25 μL PCR 反應(yīng)體系如下：9.5 μL ddH2O，12.5 μL PCR Mix，1 μL ERIC1/ERIC2引物(10 μmol·L-1)，1 μL模板DNA。PCR循環(huán)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性7 min；94 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，65 ℃ 8 min，共35個循環(huán)；65 ℃延伸15 min。采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，上樣量10 μL，電壓100 V，電泳90 min，用Gel Doc-ItTMUVP凝膠成像儀拍攝[12]。使用Quantity One對電泳圖片進(jìn)行分析，以2進(jìn)制統(tǒng)計(jì)各引物對所有樣品的擴(kuò)增條帶，有條帶記1，無條帶記0。使用軟件NTSYS Version 2.1中的Similarity法計(jì)算相似系數(shù)，使用軟件SAHN Clusteringz中的UMPGA方法進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 獼猴桃潰瘍病菌分離

通過對貴州修文感染潰瘍病的貴長獼猴桃枝條、葉片、花蕾等材料進(jìn)行獼猴桃潰瘍病病原菌分離，共分離到35株病菌(見表1)。

表1 貴州修文分離到的獼猴桃潰瘍病菌菌株

2.2 獼猴桃潰瘍病菌16S rDNA鑒定

分析結(jié)果顯示，35株分離病菌的16S rDNA序列與NCBI網(wǎng)站上的Psa菌株的同源性達(dá)到99%，在構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹上，35株細(xì)菌均與Psa聚在一支(見圖1)。說明，35株分離的獼猴桃潰瘍病病原菌為Pseudomonassyringaepv.actinidiae。

圖1 貴州修文獼猴桃潰瘍病分離菌株基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 獼猴桃潰瘍病菌ERIC-PCR多態(tài)性分析

對分離到的35株病菌進(jìn)行ERIC-PCR引物擴(kuò)增，大小片段100～2 000 bp之間(見圖2)。聚類分析結(jié)果顯示，在相似系數(shù)為0.808時，可將分離到的35株病菌分為4個不同的類群，有30株(占85.7%)屬于第一類群，同一器官(如葉片)分離到潰瘍病菌可分散在不同類群中，同一地區(qū)采集分離到的病原菌也可分散在不同類群中(見圖3)。表明，修文獼猴桃潰瘍病菌遺傳多樣性豐富。

圖2 貴州修文獼猴桃潰瘍病分離菌株ERIC-PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖3 貴州修文獼猴桃潰瘍病分離菌株基于ERIC-PCR的聚類分析結(jié)果

3 小結(jié)

在本研究中，對貴州省修文縣貴長獼猴桃感染潰瘍病的枝條、葉片、花蕾等材料進(jìn)行病菌分離，分離到35株病菌，進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA鑒定，均為Pseudomonassyringaepv.actinidiae；運(yùn)用ERIC-PCR分析病菌群體的遺傳多樣性，在相似系數(shù)為0.808時，所有菌株可分為4個類群，85.7%的菌株屬于第一類群，同時無明顯的采集地、采集部位聚類現(xiàn)象，表明貴州貴長獼猴桃潰瘍病菌存在豐富的遺傳多樣性。但本研究只在修文縣采集了一個獼猴桃品種(貴長)的潰瘍病菌進(jìn)行遺傳多樣性分析，代表程度有局限性，以后的研究應(yīng)加大采樣品種及地區(qū)數(shù)量，以便更好地闡明貴州獼猴桃潰瘍病病菌遺傳多樣性。