李國(guó)平，鄭 磊，柳 鳳

(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所/海南省熱帶園藝產(chǎn)品采后生理與保鮮重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部熱帶果樹生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江，524091)

杧果細(xì)菌性角斑病又名杧果細(xì)菌性黑斑病、杧果細(xì)菌性潰瘍病，是由柑桔黃單胞菌杧果致病變種Xanthomonascitripv.mangiferaeindicae(Xcm)引起的杧果生產(chǎn)上的主要病害。該病可為害杧果葉、莖、花和果實(shí)等大部分組織，如遇到高溫高濕或者臺(tái)風(fēng)雨天氣，病害發(fā)生尤為嚴(yán)重。該病的最大特點(diǎn)是果實(shí)染病后，果面布滿斑點(diǎn)，失去商品價(jià)值，嚴(yán)重時(shí)可造成落果失收，且該病一旦發(fā)生即使利用化學(xué)農(nóng)藥控制住其進(jìn)一步蔓延，但染病果實(shí)面上的斑點(diǎn)卻無(wú)法去除，果實(shí)商品價(jià)值大打折扣，因此預(yù)防該病發(fā)生對(duì)杧果生產(chǎn)十分重要[1]。

次生代謝在寄主植物抵御微生物侵染過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，酚類物質(zhì)是植物抗病反應(yīng)的主要次生代謝生化物質(zhì)。植物體內(nèi)酚類物質(zhì)的代謝是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，主要通過(guò)苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶等酶類催化苯丙烷代謝途徑合成木質(zhì)素、類黃酮、植保素、醌類等物質(zhì)[2-3]，這些物質(zhì)參與植物自身細(xì)胞引起過(guò)敏性反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)、木質(zhì)化形成和對(duì)毒素的應(yīng)激活性等生理過(guò)程[4-5]。研究表明，酚類物質(zhì)的升高降低與植物抗性無(wú)明顯相關(guān)性，各種物質(zhì)之間通過(guò)相關(guān)轉(zhuǎn)化從而協(xié)調(diào)作用[6-7]。本研究以細(xì)菌性角斑病高抗品種“紅杧6號(hào)”和高感品種“貴妃”杧為試材，通過(guò)比較人工接種病原菌后感病和抗病品種果實(shí)內(nèi)酚類代謝的差異，旨在闡明Xcm侵染對(duì)杧果酚類代謝的影響，豐富杧果細(xì)菌性角斑病病理的基礎(chǔ)理論，為進(jìn)一步研究病害發(fā)生的內(nèi)在機(jī)制以及杧果細(xì)菌性角斑病的防控提供有價(jià)值的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試病原菌編號(hào)Xcm003，由本實(shí)驗(yàn)室分離自杧果細(xì)菌性角斑病典型癥狀的杧果果實(shí)，致病性測(cè)定具有強(qiáng)致病力，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化測(cè)定及全基因組測(cè)序鑒定為柑桔黃單胞菌杧果致病變種Xanthomonascitripv.mangiferaeindicae[8]。根據(jù)田間表型和室內(nèi)離體接種病菌觀察的結(jié)果，選擇細(xì)菌性角斑病高抗品種“紅杧6號(hào)”和高感品種“貴妃”杧為供試杧果品種進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在本單位農(nóng)業(yè)部隔離檢驗(yàn)檢疫室內(nèi)進(jìn)行，選取健康生長(zhǎng)的“紅杧6號(hào)”和“貴妃”杧1年生實(shí)生苗，每個(gè)品種5株，以搖床培養(yǎng)48 h后濃度約為4×106cfu/mL的Xcm003懸浮液作為接種體，采用刺傷接種法接種嫩葉(黃轉(zhuǎn)綠)，接種無(wú)菌水為對(duì)照，接種后保濕培養(yǎng)，分別在接種后12、24、48、96、144、192 h取樣，每次取樣隨機(jī)選取葉片5片，重復(fù)測(cè)定3次。

多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶活性測(cè)定參照李榮花等方法加以改進(jìn)[9]。總酚、類黃酮相對(duì)含量測(cè)定參照Pirie等的方法，總酚相對(duì)含量用OD280/g·FW表示，類黃酮相對(duì)含量用OD325/g·FW表示[10]。阿魏酸相對(duì)含量參考邱永祥的方法并略有改進(jìn)[11]，木質(zhì)素相對(duì)含量參照翟艷霞的方法[12]測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2007 軟件和SPSS 10.0 for Windows軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，采用Duncan’s(鄧肯氏)進(jìn)行多重差異比較，p<0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚氧化酶活性變化

接種病菌后，杧果抗感品種葉片內(nèi)多酚氧化酶活性變化見圖1。無(wú)論是抗病品種還是感病品種，接種病菌后多酚氧化酶活性均明顯高于其對(duì)照(無(wú)菌水)處理。感病品種“貴妃”杧接種48 h就達(dá)到頂峰，是其對(duì)照(無(wú)菌水)的1.8倍，隨后一直保持較高水平?！凹t杧6號(hào)”接種病菌96 h前多酚氧化酶活性變化不明顯，與其對(duì)照(無(wú)菌水)無(wú)顯著性差異，但接種144 h后活性上升3～4倍，接種144 h“紅杧6號(hào)” 多酚氧化酶活性比其對(duì)照(無(wú)菌水)高2.6倍。綜合來(lái)看，感病品種應(yīng)激反應(yīng)較快，但是上升幅度低于抗病品種。

圖1 兩個(gè)杧果品種接種杧果細(xì)菌性角斑病菌后葉片多酚氧化酶活性變化

2.2 苯丙氨酸解氨酶活性變化

杧果抗感品種接種病菌后，葉片內(nèi)苯丙氨酸解氨酶活性變化見圖2?！凹t杧6號(hào)” “貴妃”杧葉片苯丙氨酸解氨酶活性均有所提高，在接種病菌48 h和144 h時(shí)達(dá)到各自峰值，分別為4 371 U/(g·min)和8 837.5 U/(g·min)，是其對(duì)照的2.0和6.3倍。綜合比較發(fā)現(xiàn)，接種病菌后抗感病品種苯丙氨酸解氨酶活性變化速度基本一致，但感病品種“貴妃”杧苯丙氨酸解氨酶活性升高的幅度較大。

圖2 兩個(gè)杧果品種接種杧果細(xì)菌性角斑病菌后葉片苯丙氨酸解氨酶活性變化

2.3 總酚相對(duì)含量的變化

從圖3中可以看出，接種病菌后杧果抗感病品種葉片內(nèi)總酚相對(duì)含量較各自對(duì)照(無(wú)菌水)發(fā)生明顯變化，“紅杧6號(hào)”總酚相對(duì)含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，但是總體水平明顯高于其對(duì)照(無(wú)菌水)處理。感病品種“貴妃”杧接種病菌后前期(96 h前)與其對(duì)照(無(wú)菌水)無(wú)明顯差異，總酚相對(duì)含量呈下降趨勢(shì)。綜合分析可以初步推斷，總酚相對(duì)含量與杧果抗性呈正相關(guān)。

圖3 兩個(gè)杧果品種接種杧果細(xì)菌性角斑病菌后葉片總酚相對(duì)含量變化

2.4 類黃酮相對(duì)含量的變化

類黃酮因其具有殺菌和抑菌作用，因而在植物抗病反應(yīng)中被廣泛關(guān)注。由表1可以看出，抗感品種對(duì)照(無(wú)菌水)處理的葉片類黃酮相對(duì)含量始終保持在一個(gè)穩(wěn)定狀態(tài)，其中感病品種類黃酮相對(duì)含量高于抗病品種，取樣時(shí)段的平均值分別為99.46 OD325/g和76.78 OD325/g。接種病菌后，類黃酮在抗感品種中均發(fā)生明顯變化?？共∑贩N“紅杧6號(hào)”葉片中類黃酮相對(duì)含量迅速上升，12 h增幅41.33%，24～96 h期間增幅79%以上，144～192 h趨于穩(wěn)定，但仍明顯高于清水處理。感病品種“貴妃”杧的類黃酮相對(duì)含量增幅不明顯，且后期顯著低于其對(duì)照(無(wú)菌水)。綜合分析可以推測(cè)，類黃酮相對(duì)含量變化與杧果抗性可能呈正相關(guān)。

表1 兩個(gè)杧果品種接種杧果細(xì)菌性角斑病菌后葉片類黃酮相對(duì)含量的變化

2.5 阿魏酸相對(duì)含量的變化

由表2可以看出，病菌侵染對(duì)杧果葉片中阿魏酸相對(duì)含量有明顯的影響，在抗病品種 “紅杧6號(hào)”中，阿魏酸相對(duì)含量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，24 h增幅最大，為34.78%。感病品種“貴妃”杧阿魏酸相對(duì)含量與其對(duì)照(無(wú)菌水)相比，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)不斷的減少?？共∑贩N“紅杧6號(hào)”和感病品種“貴妃杧”對(duì)照(無(wú)菌水)的比較，阿魏酸相對(duì)含量較穩(wěn)定，且差異不顯著。由此推斷阿魏酸相對(duì)含量與杧果的抗性可能呈正相關(guān)。

表2 兩個(gè)杧果品種接種杧果細(xì)菌性角斑病菌后葉片阿魏酸相對(duì)含量變化

2.6 木質(zhì)素相對(duì)含量的變化

木質(zhì)素作為植物細(xì)胞壁的主要成分，在植物抵御病菌侵染過(guò)程中起重要作用。由表3可以看出，抗病品種“紅杧6號(hào)”接種病菌后木質(zhì)素相對(duì)含量有所提高，增幅最大值出現(xiàn)在接種病菌144 h，比對(duì)照增幅17.93%。感病品種“貴妃”杧在接種病菌后木質(zhì)素相對(duì)含量變化緩慢，增長(zhǎng)幅度約5%左右。綜合比較發(fā)現(xiàn)，病菌侵染后，抗病品種木質(zhì)素相對(duì)含量提高幅度高于感病品種，可能通過(guò)增加細(xì)胞壁的厚度來(lái)抵御病菌侵入，從而達(dá)到抗病效果。

表3 兩個(gè)杧果品種接種杧果細(xì)菌性角斑病菌后葉片木質(zhì)素相對(duì)含量變化

3 結(jié)論與討論

酚類化合物是植物體本身的固有成分，是植物體次生代謝產(chǎn)物中最重要的化合物之一，參與植物色素合成、生長(zhǎng)發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗氧化機(jī)理和逆境防御等生化過(guò)程中。酚類化合物包括苯丙烷類、黃酮類、倍酸型、鞣花酸型、羥基芪類和單寧類等[3，13]。酚類化合物在植物抵御不良環(huán)境、病原物侵染的過(guò)程中起到重要的抗逆作用已引起廣泛關(guān)注，其主要通過(guò)合成抗性物質(zhì)、抑制或殺死病原細(xì)胞和刺激寄主細(xì)胞產(chǎn)生抗性反應(yīng)等方式來(lái)提高寄主的抗病能力[14]。咖啡受咖啡炭疽病菌侵染后，抗性品種在早期產(chǎn)生黃酮類、羥基肉桂酸衍生物等酚類物質(zhì)，促使咖啡發(fā)生過(guò)敏性反應(yīng)形成壞死斑和加速細(xì)胞壁的木質(zhì)化增加細(xì)胞厚度，從而進(jìn)一步阻礙病菌的蔓延[15]。唐永萍等以秦冠、富士、金冠蘋果果實(shí)為材料，通過(guò)損傷接種灰葡萄孢菌后發(fā)現(xiàn)，抗病蘋果品種通過(guò)調(diào)節(jié)果肉內(nèi)酚類物質(zhì)代謝，增強(qiáng)次生代謝能力，其中類黃酮和木質(zhì)素含量的增加強(qiáng)化了果實(shí)的抗性反應(yīng)，進(jìn)而提高對(duì)灰霉病的抗性，但總酚含量與植物抗病性關(guān)系不大[16]。張?jiān)葡嫉葹樘綄じ仕{(lán)抗黑腐病的生理生化機(jī)制，以抗病材料C7和感病材料C26為試驗(yàn)材料，在甘藍(lán)幼苗期，噴施病菌懸浮液發(fā)現(xiàn)，抗病品種和感病品種苯丙氨酸解氨酶活性均先顯著增加后迅速下降，但抗病品種的酚類物質(zhì)和木質(zhì)素含量后期無(wú)明顯變化[17]。

本研究以杧果細(xì)菌性角斑病不同抗性杧果品種為材料，研究了接種病菌后杧果葉片內(nèi)總酚、類黃酮、木質(zhì)素相對(duì)含量及酚類代謝相關(guān)酶(苯丙氨酸解氨酶和多酚氧化酶)活性的變化趨勢(shì)。結(jié)果表明，接種病菌后，感病品種“貴妃”杧和抗病品種“紅杧6號(hào)”內(nèi)總酚、類黃酮、阿魏酸、木質(zhì)素相對(duì)含量，苯丙氨酸解氨酶和多酚氧化酶活性均直線上升，其中總酚、類黃酮、阿魏酸、木質(zhì)素相對(duì)含量增幅在抗病品種中高于感病品種，且感病品種接種后期總酚和類黃酮相對(duì)含量均迅速降低；感病品種的苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶活性增幅較高。病菌侵染對(duì)杧果酚類代謝產(chǎn)生顯著影響，推測(cè)杧果葉片的總酚、類黃酮、阿魏酸、木質(zhì)素相對(duì)含量與杧果抗性呈正相關(guān)，而苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶活性與抗病性呈負(fù)相關(guān)。由于植物抗病性是一個(gè)多體系混合作用的復(fù)雜機(jī)制，酚類物質(zhì)代謝途徑與其他抗病機(jī)制如何協(xié)調(diào)互作有待進(jìn)一步研究。