周海蘭,李紹鵬,李茂富,龐新華,周俊岸,歐景莉,李菊馨,單 彬,唐桓偉,李季東
(1 廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所,南寧,530001;2 海南大學熱帶農(nóng)林學院,???,570228)
油梨PerseaamericanaMill,原產(chǎn)于熱帶美洲,為樟科(Lauraceae)鱷梨屬喬木果樹,是最具經(jīng)濟價值的亞熱帶熱帶水果之一,已在全球廣泛商業(yè)種植,生產(chǎn)發(fā)展迅速,產(chǎn)量與消費量劇增。油梨是一個高多樣性的物種,其遺傳變異產(chǎn)生了不同品系[1],分別為墨西哥種系(P.americanaMiller var.Drymifolia)、危地馬拉種系(P.americanaMiller var.Guatemalensis)和西印度種系(P.americanaMiller var.Americana)。西印度油梨原產(chǎn)于墨西哥南部和中美洲的熱帶低地地區(qū),而危地馬拉和墨西哥油梨原產(chǎn)于各自國家的中高海拔地區(qū),每個種系都有重要的經(jīng)濟性狀,如危地馬拉品種的種子小,果實成熟晚,中等耐寒;墨西哥品種早熟和耐寒,含油量高;西印度品種果實大,含油量低,耐鹽堿,但耐寒性最弱[2]。此外還有雜交種系,一般以煉油為主,代表品種有博思7(Booth 7)、博思8(Booth 8)、福爾特(Fuerte)等。油梨是集健康、營養(yǎng)、保健于一體的名貴水果,含有豐富的蛋白質(zhì)(1%~3%),大量脂溶性維生素(維生素A、B、D、E等),葉酸,大量的鈣、鉀、鎂、鈉、磷、硫、硅[3-5],深受消費者喜愛,我國栽培范圍和面積正逐年擴大,具有巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>
油梨屬異型雜交植物,研究油梨品種多樣性,對油梨的深入開發(fā)有重要意義。國外,分子標記已被證明在闡明油梨種質(zhì)的遺傳關(guān)系方面非常有用,Lavi等[6]應用4個DNA指紋探針(DFP)對油梨進行品種鑒定、特性描述及遺傳圖譜分析;Mhameed等[7]嘗試利用小衛(wèi)星DNA標記對24份油梨栽培種進行歸類、評估和分析;Furnier等[8]對葉綠體DNA、核糖體DNA和編碼纖維素酶的基因進行了限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析研究來推斷油梨的系統(tǒng)發(fā)育。此外,還有RFLP[9]、RAPD[10]、SSR[11-14]、ISSR[15]、AFLP[16-17]、SNP[18]已經(jīng)應用于油梨品種鑒定和分類、種質(zhì)資源評價、遺傳多樣性等研究。油梨種質(zhì)的遺傳圖譜也已經(jīng)利用分子標記進行構(gòu)建[19-21]。國內(nèi),RAPD、SSR已分別用于油梨品種分類[22]、授粉研究[23]及引物開發(fā)[24]。國內(nèi)關(guān)于油梨分子標記研究相對滯后,在一定程度上限制了油梨遺傳改良和育種工作的進行。本研究對油梨種質(zhì)資源圃內(nèi)收集的海南、廣西、云南等省(區(qū))的54份油梨種質(zhì)資源進行SSR分子標記分析,有利于科學評價這些種質(zhì)資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系,對于優(yōu)化油梨種質(zhì)資源圃、油梨雜交育種親本選擇有重要應用價值,可以很大程度地降低種質(zhì)資源保存的重復性,提高育種效率。
供試材料是從廣西、云南、海南等地區(qū)收集到的54份油梨種質(zhì)(見表1),所有材料均取自海南大學園藝園林學院油梨種質(zhì)資源圃。引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。Taq酶、dNTPs均購自TAKARA公司。PCR儀為Eppendorf Mastercycler Pro S,瓊脂糖凝膠電泳儀為Biometro Standard Power Pack P25,核酸蛋白儀為Nanovue plus超微量分光光度計,變性聚丙烯酰胺凝膠電泳儀為北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYY-10C型。
表1 供試油梨種質(zhì)
1.2.1 DNA的提取與檢測 選取供試種質(zhì)的健康干凈嫩葉,采用改良2×CTAB法[25]提取油梨DNA,并用核酸蛋白儀檢測DNA濃度和純度,DNA原液放置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2 SSR-PCR擴增 試驗選用Sharon等[19]和Ashworth等[26]的SSR引物序列,從中篩選出穩(wěn)定性高、重復性好、有多態(tài)性產(chǎn)物的引物23對(見表2),對油梨種質(zhì)DNA進行PCR擴增。SSR-PCR擴增的反應程序和反應體系參考文獻[25]進行。利用6%變性聚丙烯酰胺凝膠進行PCR產(chǎn)物分離,在60 W恒定功率下電泳1.5~2 h,銀染檢測參考楊珺[27]的銀染法進行。
表2 用于油梨SSR分析的23對引物序列
觀察電泳圖,統(tǒng)計擴增條帶時,按同一位置有無條帶進行1、0賦值,有帶(陽性)記為1,無帶(陰性)記為0,形成(1、0)數(shù)據(jù)矩陣。采用Popgene 1.32計算遺傳多樣性參數(shù),利用NTSYSpc 2.1軟件對統(tǒng)計數(shù)據(jù)進行遺傳相似系數(shù)計算和UPGMA法聚類,分析54份油梨種質(zhì)的親緣關(guān)系和遺傳多樣性,并根據(jù)遺傳相似系數(shù)進行主成分分析(PCA)。
試驗結(jié)果看出,23對引物擴增產(chǎn)生多態(tài)位點在2~10個之間,共產(chǎn)生多態(tài)性位點119個,平均每對引物擴增多態(tài)位點數(shù)5.17個;23對SSR引物的多態(tài)性位點百分比(PPL)均達到100%,多態(tài)性信息量(PIC)為0.04~0.39,其均值為0.33;有效等位基因數(shù)(Ne)的分布范圍為1.120 8~1.668 9,其平均值為1.321 9;Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)變異范圍為0.091 5~0.375 6,其平均值為0.205 9;Shannon’s信息指數(shù)(I)變化在0.171 3~0.553 7之間,其平均值為0.335 6(見表3和圖1)。說明試驗選用的23對SSR多態(tài)性引物對油梨種質(zhì)資源有較高的多態(tài)性檢測能力,適用于油梨種質(zhì)資源的鑒別及親緣關(guān)系分析。
注:1—54表示油梨種質(zhì)Hass、大嶺7號、Fuerte、Bacon、DKM、Pollock、大嶺2號、大嶺3號、大嶺4號、大嶺5號、大嶺8號、大嶺10~15號、大嶺17號、芙蓉田1~9號、桂肯大2號、桂肯大3號、熱研2號、熱研3號、熱研16號、熱研17號、YN003、YN005、YN006、YN010、YN011、YN016、YN020、YN022、YN027、YN028、大嶺6號、大嶺9號、大嶺16號、Y1-10、Y2-12、Y3-1、Y3-23、Y6-5、Y7-20、Y10-1。圖2和圖3同。圖1 引物AVD013對54份油梨種質(zhì)的擴增結(jié)果
根據(jù)54份油梨種質(zhì)材料間的遺傳相似系數(shù),按UPGMA法進行聚類分析,得到聚類圖。54份油梨種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)為0.59~0.97,在遺傳相似系數(shù)為0.71時,可劃分為4大類群:Fuerte單獨歸為第Ⅰ類,收集自廣西,該種質(zhì)屬雜交種系,在成熟葉片上較為特殊,葉面狀態(tài)為平展,其他品種均為凹陷,葉柄長度也最長,占葉片長度的1/3以上,明顯區(qū)別于其他種質(zhì),同時,與其他種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)最小,為0.59,說明在種質(zhì)間存在最大的遺傳差異。Hass、Bacon聚為第Ⅱ類,收集自廣西。聚為第Ⅲ類的種質(zhì)有4份,即Y1-10、Y3-1、Y6-5、Y10-1,都來自海南。余下的47份種質(zhì)聚為第Ⅳ類,占供試材料的87.04%。第Ⅳ類遺傳相似系數(shù)在0.77水平上又可分為5個亞類,第Ⅳ-1亞類包括大嶺11號、芙蓉田2號;第Ⅳ-2亞類包括大嶺4號、桂肯大3號、Y7-20,第Ⅳ-3亞類包括Y2-12,第Ⅳ-4亞類包括熱研3號,第Ⅳ-5亞類包括大嶺7號、DKM、Pollock、大嶺2號、大嶺3號、大嶺5號、大嶺8號、大嶺10號、大嶺12號、大嶺13號、大嶺14號、大嶺15號、大嶺17號、芙蓉田1號、芙蓉田3號、芙蓉田4號、芙蓉田5號、芙蓉田6號、芙蓉田7號、芙蓉田8號、芙蓉田9號、桂研10號、桂肯大2號、熱研2號、熱研16號、熱研17號、YN003、YN005、YN006、YN010、YN011、YN016、YN020、YN022、YN027、YN028、大嶺6號、大嶺9號、大嶺16號、Y3-23(見圖2)。
表3 54份油梨種質(zhì)SSR標記遺傳多樣性參數(shù)
圖2 54份油梨種質(zhì)聚類分析
為更好反應種質(zhì)間的親緣關(guān)系,基于遺傳相似系數(shù)矩陣進行主成分分析,各種質(zhì)形成的二維散點平面分布。前3個解釋總遺傳變異的主成分貢獻率依次為10.54%、7.52%和7.01%,占總遺傳變異的25.07%。在二維散點平面分布圖中,位置越近,表示親緣關(guān)系越近,反之則越遠。將位置靠近的油梨種質(zhì)劃歸在一起,共得到4個主要類群(A、B、C、D)(見圖3),相當于聚類分析結(jié)果的第Ⅰ類、第Ⅱ類、第Ⅲ類、第Ⅳ類,表明主成分分析結(jié)果與聚類分析結(jié)果相一致;主成分分析結(jié)果更直觀地反映出油梨種質(zhì)之間的親緣關(guān)系,是對聚類結(jié)果的直觀解釋和旁證,兩者結(jié)合能更全面地了解種質(zhì)間的親緣關(guān)系。
圖3 54份油梨種質(zhì)的主成分分析
本研究結(jié)果表明,油梨種質(zhì)資源具有較豐富的遺傳多樣性,SSR分子標記對其有較高的多態(tài)性檢測能力,適用于油梨種質(zhì)資源鑒定和親緣關(guān)系分析。
油梨為國外引進物種,在我國發(fā)展百年,品種選育有所成效,但資源仍舊匱乏、適栽品種較少及消費市場有限導致油梨生產(chǎn)發(fā)展十分緩慢。油梨遺傳多樣性被認為是廣泛的,但收集的種質(zhì)缺乏有力的特性描述和正確鑒定的遺傳信息,這在某種程度上限制了油梨的遺傳改良工作進行[15]。油梨形態(tài)特征往往受環(huán)境影響較大,即使同品種的果實也可在外觀表現(xiàn)出相當大的差異[16],僅根據(jù)形態(tài)學標記來鑒定種族雜種是一項困難的任務。Ashworth等[13]利用25個微衛(wèi)星標記對35份油梨栽培種和兩個野生近緣種進行遺傳差異分析;Alcaraz等[28]利用16組微衛(wèi)星序列對75份油梨種質(zhì)(西班牙本地品種和收集品種)進行分子鑒定和遺傳多樣性分析,表明所使用的SSRs具有高信息量,對油梨種質(zhì)的鑒定和管理有一定的作用??梢姡琒SR標記已被應用于油梨的品種鑒定和分類、親緣關(guān)系及遺傳多樣性研究,并具有較高的檢測效率。重要的園藝性狀,如砧木性能、果實質(zhì)量、收獲季節(jié)等都與品種有關(guān)[29],分析了解油梨種質(zhì)資源之間的親緣關(guān)系及遺傳變異,為油梨種質(zhì)資源鑒定及育種親本選擇提供參考。本研究根據(jù)聚類分析和主成分分析,54份油梨種質(zhì)可劃分為4大類群,F(xiàn)uerte單獨歸為第Ⅰ類,收集自廣西,該種質(zhì)屬雜交種系;Hass、Bacon被聚為第Ⅱ類,收集自廣西,傳統(tǒng)上Hass為危地馬拉系、Bacon為墨西哥系,遺傳相似度為71%。有研究提出許多被認為是某個品系的“純”油梨,實際上可能是品系雜交種,例如,Hass是目前商業(yè)上最重要的油梨品種,它看起來是典型的危地馬拉品種,然而,從后代分析中估計它可能含有約15%的墨西哥品系基因[10]。Fiedler等[10]對油梨品種進行RAPD遺傳關(guān)系分析研究結(jié)果表明,墨西哥品系品種和“cv.Hass”(危地馬拉系與墨西哥系雜交)聚為1個類群,遺傳相似度為60%,與本研究聚類結(jié)果基本一致,這說明本研究的供試Hass,可能是品系雜交種,不是“純”危地馬拉系品種。Y1-10、Y3-1、Y6-5、Y10-1聚為第Ⅲ類,均收集自海南。第Ⅳ類的種質(zhì)47份,占參試材料的87.04%,收集自海南、廣西、云南等地,在相似系數(shù)0.71處聚為一類,該類群中的品種Pollock為西印度系,我國選育的桂研10號、桂肯大2號、桂肯大3號、熱研2號、熱研3號、熱研16號、熱研17號也歸為該類群,這說明它們與西印度系親緣關(guān)系密切,可能來源于西印度系,該類群的其他種質(zhì)也可能屬于西印度系。分子標記在植物遺傳資源管理中是有用的,可以對油梨種質(zhì)進行更多的信息分類。收集的油梨種質(zhì)遺傳多樣性豐富,遺傳背景復雜,要明確其親緣關(guān)系需要進行更為深入的調(diào)查和研究。要鑒定油梨種質(zhì),區(qū)分同名異物或同物異名的油梨品種,除了采用分子標記技術(shù)外,還應綜合形態(tài)特征、品質(zhì)性狀等進一步評價分析才更為有效。