張凱東，強(qiáng) 遙，鄢明峰，賀 哲，虞凡霜，葉 瑩，蔣軍喜

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南昌， 330045)

柑桔黃龍病又稱柑桔黃梢病、柑桔青果病，是世界柑桔生產(chǎn)上極具毀滅性的病害，屬國內(nèi)外重要檢疫對象[1]。該病廣泛分布于亞洲、非洲、大洋洲、南美洲和北美洲的50余個(gè)國家和地區(qū)，在我國則分布于海南、廣東、廣西、福建、臺灣、云南、貴州、四川、浙江、江西和湖南11個(gè)省(自治區(qū))[2]。柑桔黃龍病的病原包括韌皮部桿菌屬中3種細(xì)菌，即亞洲韌皮部桿菌(CandidatusLiberibacter asiaticus, CLas)、非洲韌皮部桿菌(C. Liberibacter africanus, CLaf)和美洲韌皮部桿菌(C. Liberibacter americanus, CLam)[3-5]，我國的柑桔黃龍病菌為CLas[6]。

江西柑桔黃龍病最初于1978年在贛州市的安遠(yuǎn)、大余等縣發(fā)生，之后隨著柑桔苗木的頻繁調(diào)運(yùn)和柑桔木虱的逐漸北移，該病已擴(kuò)散蔓延到贛南的各縣市區(qū)，吉安的遂川、萬安、泰和3縣[7]，以及撫州的廣昌、南豐2縣[8]。近年來，在吉安的吉水縣也陸續(xù)出現(xiàn)了柑桔黃龍病的疑似病株。為了確診吉水縣柑桔黃龍病疑似病株的病原，我們采用PCR和序列測定技術(shù)進(jìn)行了柑桔黃龍病菌檢測，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 樣品采集2019年12月從吉水縣6個(gè)柑桔園共采集10份疑似柑桔黃龍病癥狀葉片樣品和2份無癥但懷疑已感染葉片樣品帶回室內(nèi)檢測，每份樣品分別來自不同的植株。樣品具體信息見表1，癥狀特征見圖1。

表1 在江西省吉水縣采集的柑桔黃龍病待測樣品的相關(guān)信息

注：各編號對應(yīng)信息見表1。圖1 在江西省吉水縣采集的柑桔黃龍病待測葉片樣品

1.2 樣品總DNA提取采用Ezup柱式植物基因組DNA提取試劑盒，按其說明提取樣品總DNA。提取的DNA最后溶于50 μL Buffer TE中，并于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴(kuò)增引物根據(jù)文獻(xiàn)[9]，選用柑桔黃龍病菌亞洲種特異性引物A2/J5對病樣進(jìn)行PCR檢測。5’端引物(A2)序列為：5’-TATAAAGGTTGACCTTTCGAGTTT-3’；3’端引物(J5)序列為：5’-ACAAAAGCAGAAATAGCACGAACAA-3’。擴(kuò)增片段長度預(yù)計(jì)703 bp，為部分核糖體蛋白基因。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 PCR擴(kuò)增及序列測定PCR反應(yīng)總體系25 μL，包括A2/J5各1 μL，2×Taq Master Mix 12.5 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后一次循環(huán)后72 ℃延伸10 min。獲得的PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物送往上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。用計(jì)算機(jī)分析軟件 DNAStar (Madison Wisconsin, USA) 處理所測序列，整理后的序列遞交到NCBI數(shù)據(jù)庫與已有序列進(jìn)行同源性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取及PCR擴(kuò)增采用試劑盒法從待測的12個(gè)樣品和陰性、陽性樣品中，均提取到了高質(zhì)量的基因組總DNA。以提取的DNA為模板，用亞洲黃龍病菌特異性引物A2/J5進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果從第5、7、8、9、11、12號樣品和陽性對照中擴(kuò)增到符合預(yù)期大小約703 bp的條帶，而從其他6個(gè)樣品和陰性對照中均未擴(kuò)增到相應(yīng)的條帶(見圖2)。

注：M為DNA marker，1—12對應(yīng)信息見表1，陰為健康植株擴(kuò)增結(jié)果，陽為患病植株擴(kuò)增結(jié)果。圖2 樣品PCR產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳

2.2 序列測定及同源性分析將出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的6個(gè)樣品(命名為JS-5、JS-7、JS-8、JS-9、JS-11和JS-12)的PCR產(chǎn)物送至上海生工生物有限公司進(jìn)行測序，返回的測序結(jié)果經(jīng)DNAStar拼接后得到長度為703 bp的序列(包含了兩端引物序列)。經(jīng)DNAStar進(jìn)行序列比對，這6個(gè)樣品的序列完全相同，序列已遞交至GenBank，登錄號為MT274584—MT274589。與GenBank中已有序列進(jìn)行同源性比較，這6個(gè)樣品的序列與柑桔黃龍病亞洲種對應(yīng)序列(基因登錄號：CP001677)的同源性均為100%。

3 討論

近年來，江西省吉水縣多個(gè)柑桔園的植株陸續(xù)出現(xiàn)葉片黃化和斑駁等疑似黃龍病的癥狀。為了明確該地區(qū)柑桔黃龍病的發(fā)生情況，利用PCR擴(kuò)增和序列測定技術(shù)對采集的12份疑似黃龍病的樣品進(jìn)行了病原檢測。結(jié)果，從6個(gè)樣品中檢測到柑桔黃龍病菌，表明吉水縣已有黃龍病發(fā)生。黃龍病的存在，對該縣的柑桔產(chǎn)業(yè)是個(gè)潛在的威脅，希望能引起當(dāng)?shù)赜嘘P(guān)部門的高度重視。

柑桔黃龍病的葉片癥狀有不對稱斑駁黃化、均勻黃化和缺素狀黃化3種類型，果實(shí)有紅鼻果等癥狀，通常認(rèn)為葉片不對稱斑駁黃化和紅鼻果是柑桔黃龍病特有的癥狀并作為田間診斷黃龍病的依據(jù)[10-11]。在本研究中，呈現(xiàn)為不對稱斑駁黃化癥狀的葉片樣品均檢測出黃龍病菌，這印證了柑桔黃龍病葉片不對稱斑駁黃化癥狀確實(shí)具有特異性。