代秋瓊，劉紅斌，崔佳麗，趙高瓊，周藝佳，梅 晶，王京昆

(1. 云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500；2. 云南省藥物研究所，云南 昆明 650111；3. 云南白藥集團(tuán)創(chuàng)新研發(fā)中心，云南 昆明 650111；4. 云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650111)

三七提取物為三七主根、三七剪口、三七大根、三七葉、三七花等多個(gè)藥用部位混合提取后的浸膏加藥用輔料而制成的擬申報(bào)臨床的新藥，其主藥為三七. 三七味甘、微苦、性溫、歸肝、胃經(jīng)，為五加 科 人 參 屬 植 物 (Panax notoginseng(Burk) F.H.Chenion)的干燥根及根莖[1]，又名參三七、田七、山漆、金不換等，是我國(guó)著名傳統(tǒng)中藥. 三七總皂苷是其主要成分，臨床應(yīng)用于心腦血管疾病以及免疫、老年癡呆、腫瘤等疾病[2-9]. 迄今為止，已從三七總皂苷（total saponins ofPanax notoginseng）中分離并鑒別出多種單體皂苷成分，如人參皂苷(Ginsenoside) Rb1、Rd、Re、Rg1和 Rg2，三七皂苷(Notoginsenoaide) R1、R2、R3和 R4等[10]. 這些成分均屬于達(dá)瑪烷型（Dammarane type）四環(huán)三萜皂苷，其中 Rg1、Rb1、R1為《中國(guó)藥典（2015版）》第一部＜三七＞質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制成分，故本研究選擇Rg1、Rb1、R1作為檢測(cè)指標(biāo)成分，以血漿中Rg1、Rb1、R1的質(zhì)量濃度表征三七提取物在大鼠體內(nèi)的暴露量[1]. 因此，本試驗(yàn)針對(duì)三七提取物中的Rg1、Rb1和R1建立高專屬性、高靈敏度的HPLC-MS/MS檢測(cè)方法并對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)研究了大鼠灌胃三七提取物后上述各活性成分的血漿藥代動(dòng)力學(xué)特征.

1 試驗(yàn)材料

1.1 儀器Agilent 1200SLHPLC（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；API3200 Q-Trap質(zhì)譜儀（美國(guó) AB公司）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) (Allegra 64 R，美國(guó)Beckman公司)；XW-80A渦旋混合器（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；MD200氮?dú)獯祾邇x（杭州奧盛儀器有限公司）；96孔板固相萃取裝置（美國(guó)Waters）；eppendorf移液器（德國(guó)eppendorf公司）；電子天平(DV215CD，上海OHAUS公司).

1.2 試藥三七提取物（云南省藥物研究所自制）；人參皂苷 Rg1對(duì)照品（w=92.4%，批號(hào)：110703?201832，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；人參皂苷Rb1對(duì)照品（w=91.2%，批號(hào)：110704?201827,中國(guó)食品藥品檢定研究院）；人參皂苷R1對(duì)照品（w=93.1%，批號(hào)：110745?201820，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；鹽酸普萘洛爾(Pro)對(duì)照品（按C16H21NO2·HCl計(jì)，w=100%；批號(hào)：100783?201202，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；甲醇、甲酸為色譜純，水為超純水.

1.3 動(dòng)物6 只 SPF 級(jí) SD 大鼠，8～9 周齡，雌雄各半，(240±40) g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2012?0001，研究通過(guò)云南省藥物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)（IACUC）審查通過(guò).

2 方法

2.1 質(zhì)譜及質(zhì)譜條件

2.1.1 色 譜 條 件 色 譜 柱 ： XBridge BEH C18Column（75 mm×φ4.6 mm，2.5 μm），Waters，USA；流動(dòng)相A：甲醇，B：0.01%甲酸?水；梯度洗脫方式見(jiàn)表 1. 流速 500 μL·min?1，柱溫 20 ℃；進(jìn)樣量 10 μL.

表 1 流動(dòng)相梯度洗脫表Tab. 1 The gradient elution table of mobile phase

2.1.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），采用正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）方式進(jìn)行檢測(cè). 對(duì)質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)：氣簾氣(CUR)172.38 kPa， 噴 霧 電 壓 (IS)5 500.00 V， 霧 化 溫 度(TEM)650.0 ℃ ， 霧 化 氣 (GS1)413.7 kPa， 輔 助 氣(GS2)413.7 kPa，碰撞氣 (CAD)medium. 人參皂苷Rg1[M + Na]+m/z：823.40，定量/定性碎片離子m/z：203.20/643.60；人參皂苷 Rb1[M + Na]+m/z：1 131.50，定量/定性碎片離子m/z：365.10/789.20；三七皂苷R1[M + Na]+m/z：955.60，定量/定性碎片離子m/z：775.50/335.30； 鹽 酸 普 萘 洛 爾 (Pro)[M + H]+m/z：260.20，定量/定性碎片離子m/z：155.10/183.10.

2.2 儲(chǔ)備液和工作液的配制分別精密稱取 Rg1、Rb1、R1化學(xué)對(duì)照品各2份，置于相應(yīng)25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得Rg1、Rb1、R1質(zhì)量濃度分別為0.667 4、0.613 4 mg·mL?1，0.539 2、0.513 9 mg·mL?1， 0.584 1、 0.563 0 mg·mL?1的 高 、低質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液.

上述各化合物高質(zhì)量濃度儲(chǔ)備液用甲醇逐級(jí)稀釋得Rg1、Rb1質(zhì)量濃度范圍分別為2.625～231.8 ng·mL?1、10.32～421.2 ng·mL?1的混合校正標(biāo)準(zhǔn)工作液，R1質(zhì)量濃度范圍為 6.500～265.5 ng·mL?1的校正標(biāo)準(zhǔn)工作液，備用. 各校正標(biāo)準(zhǔn)工作液用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線.

上述各化合物低質(zhì)量濃度儲(chǔ)備液用甲醇逐級(jí)稀釋得 Rg1、Rb1質(zhì)量濃度分別為 7.660、53.60、166.1 ng·mL?1，29.82、125.2、313.2 ng·mL?1的低、中、高質(zhì)量濃度混合質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)工作液，R1質(zhì)量濃度為 19.02、79.85、199.6 ng·mL?1的低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)工作液，備用. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)工作液用于制備質(zhì)控樣品.

用甲醇為溶劑配制質(zhì)量濃度為 320.0 ng·mL?1的鹽酸普萘洛爾內(nèi)標(biāo)工作液，備用.

2.3 三七提取物給藥制劑配制精密稱定三七提取物 3.000 8 g 置于研缽中，將 20 mL 的 5% 羧甲基纖維素鈉溶液少量多次加入并不斷研磨，直至形成質(zhì)量濃度為 0.15 g·mL?1均勻混懸液. 灌胃大鼠前，充分混勻以保證給藥量準(zhǔn)確.

2.4 三七提取物藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)與血樣采集動(dòng)物給藥前禁食12 h以上、禁食期間自由飲水，給藥后 4 h 統(tǒng)一喂飼. 每只動(dòng)物按體重以 10 mL·kg?1的給藥容積經(jīng)口灌胃給予配制好的三七提取物給藥制劑，使給藥劑量為 1.5 g·kg?1. 分別于給藥前及給藥后 5、15、30 min，1、2、4、8、24、48 h眼底靜脈叢取血 0.5 mL，3 000 r·min?1離心 15 min，分離血漿，?20 ℃下凍存、待測(cè)定.

2.5 血漿樣品的處理方法Waters Oasis μElution HLB 固相萃取板以 300 μL甲醇、300 μL 超純水順序活化，備用.

檢測(cè)Rg1、Rb1血漿樣品時(shí)的處理方法：精密吸取 40 μL 大鼠含藥血漿，渦旋混合 2 min，加入50 μL 1% 甲酸水溶液，渦旋混合 2 min，后完全轉(zhuǎn)移至已活化固相萃取板中，依序分別加200 μL超純水、200 μL 25% 甲醇淋洗，200 μL 甲醇洗脫，精密移取洗脫液 160 μL，加入 10 μL 內(nèi)標(biāo)工作液，渦旋混勻，15 000 r·min?1室溫離心 10 min，取上清液進(jìn)行HPLC-MS/MS分析檢測(cè).

檢測(cè)R1血漿樣品時(shí)的處理方法：精密吸取200 μL 大鼠含藥血漿，其它同“檢測(cè) Rg1、Rb1血漿樣品時(shí)的處理方法”（上一段）.

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用 Analyst軟件采集檢測(cè)信號(hào)并擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算血漿樣品測(cè)定值. 采用DAS 3.3.0 藥代動(dòng)力學(xué)程序計(jì)算AUC0?t、AUC0?∞、t1/2MRT、VZ/F、CLZ/F等主要藥代參數(shù)，ρmax、tmax采用實(shí)測(cè)值，其它采用統(tǒng)計(jì)矩參數(shù). 其中：AUC為藥物質(zhì)量濃度?時(shí)間曲線下面積，MRT為平均滯留時(shí)間，VZ/F為表觀分布容積，CLZ/F為清除率，t1/2為半衰期，ρmax為達(dá)峰質(zhì)量濃度，tmax為達(dá)峰時(shí)間. 采用Excel對(duì)方法學(xué)數(shù)據(jù)以及藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算與統(tǒng)計(jì)分析.

3 方法學(xué)驗(yàn)證與結(jié)果

3.1 特異性以2.1項(xiàng)下的檢測(cè)條件分別進(jìn)樣空白血漿樣品、空白血漿加標(biāo)樣品，測(cè)定，獲得提取測(cè)定離子流圖，見(jiàn)圖1. 結(jié)果顯示血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不影響人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1和鹽酸普萘洛爾的檢測(cè)，方法特異性良好.

圖 1 特異性考察圖譜Fig. 1 Specificity MRM chromatograms

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限精密移取 10 μL 校正標(biāo)準(zhǔn)工作液至離心管中，常溫氮?dú)獯蹈?，按血漿樣品處理方法精密加入相應(yīng)體積的大鼠空白血漿，渦旋混合2 min，得到不同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，處理，測(cè)定. 以檢測(cè)目標(biāo)物峰面積(As)和內(nèi)標(biāo)峰面積(Ai)的比值為縱坐標(biāo)Y，血藥質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X，采用加權(quán)最小二乘法擬合(權(quán)重1/X2)，標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2.

表 2 混合對(duì)照品中 Rg1、Rb1、R1 的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及定量下限Tab. 2 Standard curves, linear ranges and lower quantitative limits of Rg1, Rb1, and R1 in mixed reference materials

3.3 精密度與準(zhǔn)確度連續(xù) 3 d 處理 3 批定量下限、低、中、高4個(gè)質(zhì)量濃度的血漿樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度平行5份，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3. 結(jié)果顯示，精密度與準(zhǔn)確度結(jié)果符合生物樣品分析檢測(cè)要求.

表 3 Rg1、Rb1、R1 在大鼠血漿中的精密度、準(zhǔn)確度（n = 5）Tab. 3 Precision and accuracy of Rg1, Rb1 and R1 in beagle dogplasma (n = 5)

3.4 基質(zhì)效應(yīng)取來(lái)源于6個(gè)不同批次的大鼠空白血漿，提取空白基質(zhì)，常溫氮?dú)獯蹈桑?、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)工作液及內(nèi)標(biāo)溶液復(fù)溶、超聲后取上清測(cè)定；隨行測(cè)定復(fù)溶液，計(jì)算基質(zhì)效應(yīng). 結(jié)果顯示：Rg1、Rb1、R1低、中、高質(zhì)量濃度歸一化平均基質(zhì)效應(yīng)(91.58±15.59)%、(94.49±2.18)%、(82.75±4.74)%；說(shuō)明基質(zhì)對(duì) Rg1、Rb1、R1的影響較小，且對(duì)各質(zhì)量濃度影響程度一致，滿足生物樣品分析檢測(cè)要求.

3.5 殘留率以“線性最高質(zhì)量濃度點(diǎn)樣品?空白血漿樣品”順序交叉進(jìn)樣，計(jì)算空白血漿樣品中殘留峰面積與定量下限樣品中峰面積比值評(píng)價(jià)殘留率.結(jié)果顯示Rg1、Rb1、R1殘留率范圍分別為7.97%～15.20%、0.53%～1.04%、0.60%～1.20%，均小于20%；內(nèi)標(biāo)鹽酸普萘洛爾殘留率范圍0.04%～0.13%，小于5%；表明進(jìn)樣殘留不影響樣品的分析檢測(cè).

3.6 穩(wěn)定性

3.6.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液穩(wěn)定性考察 處理、測(cè)定得到Rg1、Rb1、R1、鹽酸普萘洛爾儲(chǔ)備液于 2～8 ℃ 放置125 d后的峰面積與新鮮制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積，計(jì)算兩時(shí)間點(diǎn)相對(duì)偏差RE值分別為5.39%、2.87%、1.14%、0.59%，結(jié)果表明上述儲(chǔ)備液于2～8 ℃ 至少可以放置 125 d.

3.6.2 質(zhì)控樣品穩(wěn)定性考察 分別考察低、中、高質(zhì)量濃度血漿質(zhì)控樣品于室溫放置1 d，?10～?35 ℃ 放置 72 d 及 72 d 內(nèi)凍結(jié)—融化循環(huán) 5 次的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示上述每一考察條件下，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均小于15%. 表明血漿質(zhì)控樣品在上述考察條件下存放穩(wěn)定.

3.7 藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用本文所建立的檢測(cè)方法，對(duì)血漿樣品進(jìn)行檢測(cè). 血漿中Rg1、Rb1和R1的平均藥時(shí)曲線見(jiàn)圖2，體內(nèi)主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表4.

圖 2 人參皂苷 Rg1、Rb1 和三七皂苷 R1 的平均藥時(shí)曲線圖Fig. 2 Average drug time curve of ginsenoside Rg1, Rb1 and notoginsenoside R1

表 4 SD大鼠單次經(jīng)口灌胃三七提取物后血漿中人參皂苷Rb1、Rg1和三七皂苷R1的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab. 4 Pharmacokinetic parameters of ginsenoside Rg1, Rb1 and notoginsenoside R1 in plasma of SD rats after single oral administration of Notoginseng extract

4 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)血漿樣品前處理進(jìn)行考察，首先采用了沉淀法、固相萃取法對(duì)血漿樣品進(jìn)行考察[11-12]，結(jié)果表明沉淀法的基質(zhì)效應(yīng)強(qiáng)、回收率低不能滿足生物樣品檢測(cè)要求. 固相萃取法處理后所得血漿樣品，用HPLC-MS/MS方法檢測(cè)后結(jié)果可知，受血漿內(nèi)源性物質(zhì)的干擾較小，其殘留率、回收率及精密度、準(zhǔn)確度，均能達(dá)到生物樣品檢測(cè)要求，可為三七提取物的藥代動(dòng)力學(xué)研究以及臨床用藥和臨床評(píng)價(jià)提供可借鑒的方法工具.

大鼠經(jīng)口單次灌胃三七提取物1 500 mg/kg后，從獲得的藥代參數(shù)結(jié)果來(lái)看，平均AUC0-t、ρmax、t1/2、MRT0-t的數(shù)值大小，Rb1＞＞ Rg1＞ R1，平均Tmax的數(shù)值大小，Rb1＞＞ R1＞ Rg1；Rg1、R1 在大鼠體內(nèi)具有相似的藥代特征，吸收快、消除快；Rb1具有與Rg1、R1完全不同的藥代特征，吸收慢、消除慢；在大鼠體內(nèi)Rb1血漿暴露占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，血漿暴露量最大，AUC0-t分別為 Rg1、R1的 204、400倍，ρmax分別為 Rg1、R1的 16、24倍；從 Rg1、Rb1和R1的表觀分布容積來(lái)看，Rb1可能主要分布于血漿中，Rg1、R1可能主要分布于組織和體液中，需要后續(xù)更深入的組織分布研究來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證.