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（青海省婦女兒童醫(yī)院，青海西寧810007）

在過去的幾十年里，肥胖發(fā)生率在世界范圍內(nèi)急劇上升，甚至已經(jīng)達(dá)到流行病的程度［1］。肥胖是多種代謝性疾病的根源，現(xiàn)在的研究表明，肥胖和營養(yǎng)不良，心血管疾病，糖尿病具有顯著相關(guān)性［2］。近些年，營養(yǎng)過剩導(dǎo)致的肥胖已取代營養(yǎng)不良成為我國主要的營養(yǎng)健康問題［3］。高脂肪高能量飲食結(jié)構(gòu)可提高肥胖和代謝性疾病發(fā)生率，同時(shí)女性圍產(chǎn)期肥胖或高脂飲食攝入可增加子代肥胖和代謝紊亂發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)［4］。胎兒暴露于高血脂水平的子宮環(huán)境中可引起自身大腦發(fā)育和代謝功能的重要改變［5］，女性圍產(chǎn)期肥胖對(duì)子代運(yùn)動(dòng)能力和學(xué)習(xí)記憶行為的損傷機(jī)制研究并不十分充分。

本實(shí)驗(yàn)主要通過高脂飲食（high-fat diet，HFD）喂養(yǎng)母鼠16 周建立母鼠肥胖模型，通過轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)，曠場實(shí)驗(yàn)研究了雄性子代小鼠運(yùn)動(dòng)能力的變化，通過水迷宮、新物體識(shí)別等實(shí)驗(yàn)研究了子代小鼠學(xué)習(xí)記憶行為的改變，最后我們通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察了子代小鼠海馬齒狀回（dentate gyrus，DG）神經(jīng)元的分化和結(jié)構(gòu)變化。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí) C57BL/6J 母鼠 24 只和雄鼠 8 只購自南京模式生物，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（蘇）2018-0002，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為No.0016432。所有小鼠飼養(yǎng)在SPF 級(jí)動(dòng)物房中，可自由進(jìn)食進(jìn)水，動(dòng)物房室溫（22±1）℃，晝夜循環(huán)12 h。母鼠被隨機(jī)分為標(biāo)準(zhǔn)（脂肪含量為15%）飲食組（control 組）和高脂（脂肪含量58%）飲食組（HFD 組）。母鼠高脂飲食或標(biāo)準(zhǔn)喂養(yǎng)16 周建立肥胖模型，隨后每3 只母鼠與1只雄性同籠交配，雄性小鼠斷奶后與母鼠分離并正常飲食飼養(yǎng)至5 周齡進(jìn)行相關(guān)動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)，每組13只。本研究中所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均通過青海省婦女兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)審查并遵從動(dòng)物福利3R原則。

2 主要試劑與儀器信息

BrdU、鼠抗DCX 抗體和鼠抗BrdU 抗體（Sigma）；熒光Ⅱ抗（Thermo Fisher）。主要儀器包括轉(zhuǎn)棒測試儀、曠場實(shí)驗(yàn)、水迷宮測試裝置。曠場實(shí)驗(yàn)及水迷宮測試所用設(shè)備為實(shí)驗(yàn)室自制；監(jiān)測系統(tǒng)及分析軟件購自Noldus。

3 方法

3.1 小鼠腦組織分離及切片 在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取小鼠腦組織。戊巴比妥鈉麻醉小鼠，斷頸后快速取出完整腦組織，置于4%多聚甲醛中固定過夜。第2 天開始在4℃下分別在20%和30%蔗糖溶液中依次脫水過夜。使用冷凍切片機(jī)連續(xù)切割獲得小鼠海馬切片，保存在-80℃下。

3.2 免疫熒光實(shí)驗(yàn) BrdU（100 mg/kg）通過腹腔注射至小鼠體內(nèi)，第1 次注射后每2 h 注射1 次，共5次，注射完畢后3 周處死小鼠，取材并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將腦片置于PBS 中洗滌3 次后，采用0.3% Triton 溶液處理30 min，隨后用山羊血清在37℃下封閉1 h。室溫孵育Ⅰ抗（抗DCX抗體1∶1 000，抗BrdU抗體1∶1 500）1 h 后4℃過夜。第2 天洗去Ⅰ抗后滴加熒光Ⅱ抗（1∶500）并室溫孵育1 h。隨機(jī)選取3 個(gè)視野，通過ImageJ軟件分析。

3.3 轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn) 小鼠在轉(zhuǎn)棒疲勞機(jī)上訓(xùn)練2 d，每天2次，每次次訓(xùn)練5 min，轉(zhuǎn)棒勻速從8 r/min開始后以4 r/d的增速遞增至20 r/min。隨后進(jìn)行連續(xù)3 d的測試，轉(zhuǎn)棒儀速度設(shè)置為20 r/min，記錄小鼠掉落的時(shí)間。

3.4 足跡分析 將小鼠放置在平板玻璃跑道上面，引誘動(dòng)物從跑道一端行走到另一端，同時(shí)在跑道下面使用高速攝像機(jī)對(duì)動(dòng)物足跡進(jìn)行錄像。通過對(duì)動(dòng)物行走足跡視頻的分析，即可獲得動(dòng)物步態(tài)的各個(gè)參數(shù)。

3.5 曠場實(shí)驗(yàn) 小鼠在曠場所在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)1 h后，分別放入曠場中，記錄5 min 的自發(fā)活動(dòng)，末只小鼠行為結(jié)束后使用75%乙醇清潔曠場地板。使用Noldus 軟件記錄和分析小鼠運(yùn)動(dòng)總距離和中央?yún)^(qū)域運(yùn)動(dòng)距離。由對(duì)分組不知情的其他專業(yè)實(shí)驗(yàn)人員來分析小鼠站立情況。

3.6 水迷宮實(shí)驗(yàn) 將小鼠放入隨機(jī)四個(gè)象限之一作為起始象限，記錄動(dòng)物找到水下平臺(tái)的時(shí)間。每只動(dòng)物每天訓(xùn)練4次，兩次訓(xùn)練之間間隔15～20 min，連續(xù)訓(xùn)練5 d。最后一次訓(xùn)練結(jié)束后的第2 天，將平臺(tái)撤除，開始1 min 的探查訓(xùn)練。將動(dòng)物從原先平臺(tái)所在位置的對(duì)側(cè)象限放入水中，記錄動(dòng)物在目標(biāo)象限所花的時(shí)間和進(jìn)入該象限的次數(shù)，以此作為空間記憶的檢測指標(biāo)。

3.7 十字高架迷宮實(shí)驗(yàn) 小鼠在十字高架迷宮所在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)1 h 后，分別進(jìn)行十字高架迷宮實(shí)驗(yàn)。開始時(shí)，將小鼠放入迷宮閉合臂中，記錄5 min 小鼠的活動(dòng)后進(jìn)行相關(guān)分析。

3.8 新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn) 第1 天將小鼠放入場地適應(yīng)10 min。第2 天，在場地中放入2 個(gè)完全相同的A物體，記錄放入小鼠之后小鼠與這兩個(gè)物體接觸的情況。第3 天，將場地內(nèi)的其中一個(gè)物體換作B 物體，觀察小鼠5 min 內(nèi)對(duì)兩個(gè)物體的探究情況。統(tǒng)計(jì)小鼠探索A 和B 物體的時(shí)間，計(jì)算Discrimination Index。

3.9 Y 迷宮實(shí)驗(yàn) 小鼠由起始臂放入，在起始臂和其他臂中自由活動(dòng)10 min，訓(xùn)練結(jié)束后，小鼠被放回飼養(yǎng)籠。1 h 后進(jìn)行第2 個(gè)階段實(shí)驗(yàn)。第2 個(gè)階段為檢測期，抽開新異臂隔板，小鼠由起始臂放入，在3個(gè)臂中自由活動(dòng)5 min。錄像記錄5 min 內(nèi)每只小鼠在各個(gè)臂停留的時(shí)間和穿梭次數(shù)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 21.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。兩組之間比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 母代高脂飲食對(duì)子代小鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性的影響

小鼠足跡分析結(jié)果顯示，相比于正常飲食母鼠的子代，高脂飲食組子代小鼠足跡角度顯著降低（P＜0.01），見圖1A。在轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)中，正常飲食組母鼠子代掉落時(shí)間逐漸增加，而高脂飲食組子代小鼠在實(shí)驗(yàn)的3 d過程中，在轉(zhuǎn)棒停留的時(shí)間顯著低于正常飲食組母鼠子代（P＜0.01），見圖1B。

Figure 1.Effect of maternal high-fat diet（HFD）on motor coordination of offspring mice.A：statistic results of the foot angle；B：the stay time on the rotarod.Mean±SEM. n=8.**P＜0.01 vs control group.圖1 母代高脂飲食對(duì)子代小鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性的影響

2 母代高脂飲食對(duì)子代小鼠運(yùn)動(dòng)能力的影響

本實(shí)驗(yàn)通過曠場實(shí)驗(yàn)研究了母代高脂飲食對(duì)子代小鼠運(yùn)動(dòng)能力的影響，結(jié)果顯示，相比于正常飲食母鼠的子代，高脂飲食母鼠子代小鼠直立次數(shù)顯著降低（P＜0.01），見圖2A；實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)運(yùn)動(dòng)總距離相比于對(duì)照組顯著降低（P＜0.01），見圖2B。并且，高脂飲食母鼠子代小鼠在曠場中心停留時(shí)間相比于正常飲食母鼠子代小鼠顯著降低（P＜0.01），見圖2C。

3 母代高脂飲食對(duì)子代小鼠記憶行為的影響

本實(shí)驗(yàn)通過水迷宮等實(shí)驗(yàn)研究母代高脂飲食對(duì)子代小鼠記憶行為的影響，結(jié)果顯示，相比于正常飲食母鼠的子代，母代高脂飲食子代小鼠逃避潛伏期顯著升延長（P＜0.01），平臺(tái)移除后在平臺(tái)所在象限停留時(shí)間顯著降低（P＜0.01），見圖3A、B。十字高架迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，母代高脂飲食子代相比于對(duì)照組連續(xù)兩次進(jìn)入不同臂的次數(shù)顯著降低（P＜0.01），見圖3C。在新物體識(shí)別和Y 迷宮實(shí)驗(yàn)中，母代高脂飲食子代相比于對(duì)照組新物體偏好指數(shù)顯著降低（P＜0.01），見圖3D、E。

4 母代高脂飲食對(duì)子代小鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的影響

免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，母代高脂飲食子代小鼠海馬齒狀回DCX染色神經(jīng)元數(shù)目相比于正常飲食母鼠的子代顯著降低（P＜0.01），說明神經(jīng)元分化程度顯著降低，見圖4A。隨后我們對(duì)DG 區(qū)神經(jīng)元樹突結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，染色結(jié)果顯示，母代高脂飲食子代小鼠DG 區(qū)神經(jīng)元樹突長度明顯降低（P＜0.01），分支程度也顯著降低，見圖4B。

討 論

研究表明女性圍產(chǎn)期肥胖或高脂飲食攝入會(huì)現(xiàn)在增加子代肥胖和代謝紊亂發(fā)生率［6］，然而其是否能影響子代運(yùn)動(dòng)能力和學(xué)習(xí)記憶行為卻并不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)和曠場實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高脂飲食母鼠子代運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性和運(yùn)動(dòng)能力顯著下降，水迷宮實(shí)驗(yàn)、新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高脂飲食母鼠子代學(xué)習(xí)能力顯著下降，同時(shí)其海馬DG 神經(jīng)元分化程度和復(fù)雜程度均下降。在實(shí)驗(yàn)選擇中，考慮到雌鼠具有生理周期這一現(xiàn)象，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有較大干擾，在這里我們?yōu)榱说玫酱_切的觀察結(jié)果，只納入了雄性小鼠進(jìn)行觀察，以期得到確切結(jié)論。青春后期是許多精神疾病，如精神分裂、抑郁等的高發(fā)年齡，在此我們選擇青春后期小鼠進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

近幾十年，肥胖已經(jīng)逐漸成為世界性的公共衛(wèi)生問題。肥胖發(fā)生的主要原因是能量攝取與支出的平衡失調(diào)，然而現(xiàn)在的研究發(fā)現(xiàn)青少年肥胖與其母親圍產(chǎn)期肥胖和高脂飲食結(jié)構(gòu)具有顯著相關(guān)性［7］。有研究報(bào)道，孕婦的營養(yǎng)條件尤其是高脂飲食，可直接影響子代棕色脂肪的正常產(chǎn)熱［8］。鄧佳等［9］報(bào)道，母鼠孕期和哺乳期高脂飲食能夠誘導(dǎo)子代出現(xiàn)糖脂代謝紊亂，他們同時(shí)發(fā)現(xiàn)雄性子鼠更易出現(xiàn)肥胖、糖耐量異常、胰島素抵抗等代謝障礙。鄧佳等［10］研究發(fā)現(xiàn)母鼠及斷乳后高脂飲食能導(dǎo)致子代雄鼠糖脂代謝異常和腸道菌群失調(diào)。這些結(jié)果提示我們雄性子代對(duì)母鼠高脂飲食后果的敏感性。本實(shí)驗(yàn)通過16周的高脂飲食喂養(yǎng)母鼠直至哺乳期結(jié)束建立母鼠肥胖模型，選取了子代雄鼠作為主要研究對(duì)象，以觀察母鼠高脂飲食對(duì)子代運(yùn)動(dòng)能力和學(xué)習(xí)記憶的影響。小鼠足跡分析和轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，母鼠高脂飲食可顯著降低子代小鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性，而在曠場實(shí)驗(yàn)中，子代小鼠垂直水平運(yùn)動(dòng)能力均受損。我們的實(shí)驗(yàn)首次揭示了母鼠高脂飲食對(duì)子代雄性小鼠運(yùn)動(dòng)能力可以造成損傷。

Figure 2.Effect of maternal high-fat diet（HFD）on motor ability of offspring mice.Mean±SEM. n=10.**P＜0.01 vs control group.圖2 母代高脂飲食對(duì)子代小鼠運(yùn)動(dòng)能力的影響

Figure 3.Effect of maternal high-fat diet（HFD）on memory behavior of offspring mice.A：the escape latency in water maze experiment；B：the percentage in the target quadrant；C：the number of cross arm；D：the preference index in new object recognition（NOR）experiment；E：the preference index in Y-maze.Mean±SEM. n=8.**P＜0.01 vs control group.圖3 母代高脂飲食對(duì)子代小鼠記憶行為的影響

Figure 4.Effect of maternal high-fat diet（HFD）on neuron maturation of offspring mice.A：representative images of BrdU（red）and DCX（green）immunostaining in the DG and quantitative analysis of the percentage of total BrdU+ cells that were BrdU+DCX+；B：representative images and examples of DCX（red）immunostaining in the DG and quantitative analysis of the total dendritic length of DCX+neurons in the DG.Mean±SEM. n=13.**P＜0.01 vs control group.圖4 母代高脂飲食對(duì)子代小鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的影響

胚胎期是大腦等器官發(fā)育形成的關(guān)鍵時(shí)期，母體超重或肥胖可引起宮內(nèi)環(huán)境改變，導(dǎo)致胎兒在異常的生長環(huán)境中發(fā)育，從而精神疾病易感性上升［11］。Zilkha 等［12］報(bào)道母鼠高脂飲食可導(dǎo)致子鼠小鼠認(rèn)知行為改變，并且子代小鼠顯示出自閉樣行為。周余蕾等［13］曾報(bào)道，母鼠高脂飲食可導(dǎo)致子鼠小鼠抑郁樣行為，且學(xué)習(xí)能力受損。然而這些研究都集中在母鼠孕期和哺乳期高脂飲食，母鼠長期高脂飲食導(dǎo)致的肥胖對(duì)子代小鼠認(rèn)知和學(xué)習(xí)能力的影響并不清楚。與這些結(jié)果研究結(jié)果類似，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣顯示出子鼠小鼠學(xué)習(xí)能力受損。在水迷宮實(shí)驗(yàn)中高脂飲食母鼠子代小鼠潛伏期延長，在平臺(tái)撤去后象限停留時(shí)間縮短。同時(shí)在新物體識(shí)別和Y 迷宮實(shí)驗(yàn)中，高脂飲食組子代小鼠對(duì)新物體的偏好顯著下降。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)在曠場實(shí)驗(yàn)中，高脂飲食組子代小鼠中央停留時(shí)間下降，在高架十字迷宮中子代穿越次數(shù)降低，這些結(jié)果提示了子代小鼠可能出現(xiàn)焦慮樣行為，然而母代高脂飲食對(duì)子代焦慮情緒的影響還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。

在成年海馬神經(jīng)發(fā)生過程中，海馬DG 區(qū)中的成年神經(jīng)前體細(xì)胞可持續(xù)分化成成熟神經(jīng)元，這些神經(jīng)元對(duì)海馬依賴的學(xué)習(xí)記憶和空間運(yùn)動(dòng)能力具有重要作用［14-15］。我們對(duì)子代小鼠DG區(qū)神經(jīng)元進(jìn)行了染色分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示母代高脂飲食子代小鼠DG 區(qū)神經(jīng)元分化程度顯著降低且神經(jīng)元樹突長度和分支明顯降低。我們因此考慮母代高脂飲食通過影響子代小鼠海馬神經(jīng)發(fā)生損傷了小鼠運(yùn)動(dòng)和學(xué)習(xí)能力。

綜上所述，我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)母代高脂飲食可損傷子代小鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性和運(yùn)動(dòng)能力，同時(shí)小鼠顯示出學(xué)習(xí)記憶障礙，其機(jī)制可能與子代小鼠海馬神經(jīng)發(fā)生損傷有關(guān)。然而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果僅來自于雄性子代小鼠，關(guān)于母代高脂飲食對(duì)子代雌性小鼠運(yùn)動(dòng)和學(xué)習(xí)能力的作用，以及子代性別在其中的差異及原因還需要進(jìn)一步研究。