張 晴， 李泳祺， 孫小涵， 葉露雯， 閆勇勇， 黃慶東， 侯 丹

（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室，廣州市口腔再生醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教研室，廣東廣州510182）

骨肉瘤是一類起源于骨間葉細(xì)胞的原發(fā)性惡性骨腫瘤，在兒童和青少年中發(fā)病率較高，由于好發(fā)于血運(yùn)豐富的干骺端，因此具有較高的肺轉(zhuǎn)移率（約為10%～20%）和復(fù)發(fā)率，成為導(dǎo)致患者死亡的主要原因之一［1］。臨床治療主要以手術(shù)切除和化療為主，術(shù)后患者5 年總體生存率由20% 提高到60%～70%［2-3］。盡管骨肉瘤治療方案有所改善，但臨床治療仍面臨諸多挑戰(zhàn)，如化療藥物的毒副作用、腫瘤細(xì)胞的耐藥性、腫瘤的復(fù)發(fā)及肺部轉(zhuǎn)移等。

乳酸鏈球菌素（nisin）是乳酸鏈球菌（Lactococcuslactis）產(chǎn)生的低分子量五環(huán)抗菌肽，由34 個(gè)氨基酸殘基組成，具有廣譜抗菌活性和安全性［4］。1988年被食品和藥品管理局FDA 批準(zhǔn)用于食品防腐劑［5］。最近的研究發(fā)現(xiàn)乳酸鏈球菌素具有抑制多種腫瘤細(xì)胞（頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、皮膚癌、結(jié)腸癌細(xì)胞和人星形細(xì)胞瘤細(xì)胞等）生長(zhǎng)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用［6-9］。然而，乳酸鏈球菌素對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞的作用效果及其抗腫瘤的機(jī)制還不明確。本研究旨通過(guò)觀察乳酸鏈球菌素對(duì)人骨肉瘤MG63細(xì)胞活力、凋亡及線粒體功能的影響，探討乳酸鏈球菌素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與細(xì)胞氧化應(yīng)激之間的關(guān)系，以期進(jìn)一步明確其抗腫瘤的作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)材料

乳酸鏈球菌素Z（3.8×107U/g）購(gòu)自浙江銀象生物工程有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗（青霉素和鏈霉素）和0.25%胰蛋白酶購(gòu)自Gibco；本研究所使用的抗體均購(gòu)自Cell Signaling Technology；CCK-8購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所；annexin V-FITC/PI試劑盒、活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）檢測(cè)試劑盒［采用2′，7′-二氯熒光素二乙酸酯（2′，7′-dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA）法］和5，5′，6，6′-四氯-1，1′，3，3′四乙基苯并咪唑羰花青碘化物（5，5′，6，6′-tetrachloro-1，1′，3，3′-tetraethyl benzimidazolyl carbocyanine iodide，JC-1）線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海貝博生物科技有限公司；N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。人骨肉瘤細(xì)胞系MG63 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞庫(kù)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞使用含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

2.2 CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力 細(xì)胞傳代接種于96孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要加入不同濃度藥物，于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，加藥后24 h 加入CCK-8（每孔10 μL），繼續(xù)放入培養(yǎng)箱孵育2 h 后，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度（A）值。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)及annexin V-FITC/PI 雙染法檢測(cè)凋亡 給予不同濃度的藥物處理細(xì)胞后，使用不含EDTA 的胰酶收集細(xì)胞，經(jīng) PBS 洗滌后，加入 400 μL結(jié)合緩沖液重懸，加入Annexin V-FITC 染液避光孵育15 min，隨后加入PI 染液避光染色5 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

2.4 DCFH-DA 熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ROS 水平經(jīng)不同濃度藥物處理后，常規(guī)消化離心，重懸浮于DCFH-DA 濃度為 20 mol/L 的 PBS 緩沖液中，培養(yǎng)箱孵育20 min 后，PBS 洗滌細(xì)胞1 次，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。

2.5 JC-1熒光探針檢測(cè)MMP 的變化 細(xì)胞經(jīng)藥物處理后，常規(guī)消化離心，加入JC-1 染色工作液（5 μmol/L），于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 min，離心收集細(xì)胞，500 μL 孵育緩沖液重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。在線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中，形成聚合物，產(chǎn)生紅色熒光，在線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1 不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時(shí)JC-1 為單體形式，產(chǎn)生綠色熒光。

2.6 Western blot 檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的水平 細(xì)胞經(jīng)藥物處理后，裂解細(xì)胞，使用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，加入上樣緩沖液煮樣變性，SDS-PAGE 分離后轉(zhuǎn)膜，Ⅰ抗封閉過(guò)夜，次日Ⅱ抗室溫封閉1 h，加入化學(xué)底物發(fā)光液，暗室曝光、顯影、定影，拍照保存。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 6.0 作圖，采用SPSS 21.0軟件統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），先檢驗(yàn)方差齊性，若方差齊則各組均數(shù)間的兩兩比較采用Bonferroni 校正的t檢驗(yàn)，若方差不齊則使用Dunnett T3 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 乳酸鏈球菌素對(duì)人骨肉瘤MG63 細(xì)胞活力及凋亡的影響

不同濃度（0、200、400、600 和800 mg/L）乳酸鏈球菌素處理骨肉瘤MG63細(xì)胞24 h，CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)乳酸鏈球菌素對(duì)細(xì)胞活力的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)乳酸鏈球菌素的濃度達(dá)到400 mg/L 時(shí)，細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.01），隨著給藥濃度的增加，腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞活力顯著降低，呈濃度依賴性，見(jiàn)圖1A。為進(jìn)一步研究乳酸鏈球菌素是否可以誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡，使用annexin V/PI 染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示，隨著乳酸鏈球菌素濃度的增加，細(xì)胞凋亡率逐漸升高，在600 mg/L 濃度時(shí)，細(xì)胞的凋亡率顯著上升（P＜0.01），早期凋亡（annexin V+/PI-）和晚期凋亡（annexin V+/PI+）的細(xì)胞比例分別達(dá)到8.6%和68.3%，見(jiàn)圖1B。Western blot 檢測(cè)結(jié)果表明，經(jīng)乳酸鏈球菌素處理骨肉瘤MG63細(xì)胞24 h后，抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)降低，cleaved caspase-3 的蛋白水平顯著升高（P＜0.01），促凋亡蛋白Bax 與抗凋亡蛋白Bcl-2的比值升高（P＜0.05），見(jiàn)圖1C。

Figure 1.Nisin inhibited the viability and induced the apoptosis of MG63 cells.A：effects of nisin（24 h）on the cell viability（n=5）；B：effects of nisin（24 h）on apoptosis（n=3）；C：the protein levels of Bax，Bcl-2，and cleaved caspase-3 after nisin treatment for 24 h（n=3）.Mean±SD.*P＜0.05，**P＜0.01 vs 0 mg/L group.圖1 Nisin抑制MG63細(xì)胞活力并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

2 乳酸鏈球菌素誘導(dǎo)人骨肉瘤MG63 細(xì)胞內(nèi)ROS生成增多和MMP下降

為研究乳酸鏈球菌素對(duì)MG63 細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)DCFH-DA 熒光探針檢測(cè)不同濃度（0、400和600 mg/L）乳酸鏈球菌素處理骨肉瘤MG63細(xì)胞24 h后細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化，結(jié)果顯示，隨著乳酸鏈球菌素濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)ROS 的生成逐漸增多（P＜0.01），見(jiàn)圖2A。另外本實(shí)驗(yàn)使用JC-1 探針檢測(cè)MG63 細(xì)胞經(jīng)不同濃度乳酸鏈球菌素處理24 h后MMP 的變化，結(jié)果顯示，隨著給藥濃度的增加，含有JC-1 單體的細(xì)胞比例逐漸增多（P＜0.01），且在濃度為600 mg/L 時(shí)，含JC-1 單體的細(xì)胞比例達(dá)到67.6%，表明MG63 細(xì)胞經(jīng)乳酸鏈球菌素處理后，MMP顯著降低，見(jiàn)圖2B。

Figure 2.Nisin promoted reactive oxygen species（ROS）production and reduced mitochondrial membrane potential（MMP）in MG63 cells.A：effects of nisin（24 h）on intracellular ROS level of MG63 cells；B：effects of nisin（24 h）on the MMP.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs 0 mg/L group.圖2 Nisin促進(jìn)MG63細(xì)胞ROS產(chǎn)生，降低MMP

3 NAC 抑制乳酸鏈球菌素對(duì)人骨肉瘤MG63 細(xì)胞的促凋亡作用

使用不同濃度的（0、1、2 和5 mmol/L）抗氧化劑NAC 預(yù)處理 MG63 細(xì)胞 1 h 后，與 800 mg/L 乳酸鏈球菌素聯(lián)合處理細(xì)胞24 h，CCK-8 法檢測(cè)乳酸鏈球菌素對(duì)細(xì)胞活力的影響，結(jié)果顯示，與單獨(dú)乳酸鏈球菌素處理組相比，經(jīng)NAC 預(yù)處理可以顯著減弱乳酸鏈球菌素引起的MG63 細(xì)胞活力的降低（P＜0.05），并且當(dāng)NAC 濃度為5 mmol/L 時(shí)抑制效果最為顯著（P＜0.01），見(jiàn)圖3A。同樣地，使用5 mmol/L NAC 預(yù)處理細(xì)胞MG63 細(xì)胞1 h 后，聯(lián)合不同濃度乳酸鏈球菌素處理細(xì)胞24 h，經(jīng)annexin V/PI 染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和Western blot 檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的水平。結(jié)果表明，與乳酸鏈球菌素單獨(dú)處理組相比，NAC 預(yù)處理可以顯著抑制乳酸鏈球菌素引起的細(xì)胞凋亡率的升高（P＜0.01），促進(jìn)Bcl-2 的表達(dá)，顯著降低cleaved caspase-3的蛋白水平（P＜0.01），Bax/Bcl-2的比值也顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖3B、C。

4 NAC 降低乳酸鏈球菌素引起的MG63 細(xì)胞內(nèi)ROS水平的增加，恢復(fù)MMP

經(jīng) 5 mmol/L NAC 預(yù)處理 MG63 細(xì)胞 1 h 后，聯(lián)合600 mg/L 乳酸鏈球菌素處理細(xì)胞24 h，DCFH-DA 熒光探針和JC-1 探針?lè)謩e檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS 水平和MMP的變化，結(jié)果顯示，與單獨(dú)乳酸鏈球菌素處理組相比，NAC 預(yù)處理可減輕乳酸鏈球菌素引起的ROS水平的增加（P＜0.01），恢復(fù)降低的MMP（P＜0.01），見(jiàn)圖4。

討 論

乳酸鏈球菌素是一種天然無(wú)毒的低分子量抗菌肽，其抗菌作用機(jī)制明確，在食品防腐和胃及十二指腸潰瘍、口腔潰瘍、皮膚病、結(jié)核病及乳腺炎臨床治療方面應(yīng)用廣泛［10-13］。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)乳酸鏈球菌素可以抑制多種腫瘤的生長(zhǎng)，如皮膚癌、頭頸部鱗癌、結(jié)腸癌和人星形細(xì)胞癌等。本研究結(jié)果顯示，乳酸鏈球菌素處理人骨肉瘤MG63細(xì)胞24 h后，呈濃度依賴性抑制細(xì)胞活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

Figure 3.NAC attenuated nisin-induced apoptosis of MG63 cells.A：effects of nisin on cell viability（24 h）with NAC pretreatment（n=5）；B：effects of nisin（24 h）on apoptosis with NAC pretreatment（n=3）；C：the protein levels of Bax，Bcl-2 and cleaved caspase-3 after nisin treatment for 24 h with NAC pretreatment（n=3）.Mean±SD.*P＜0.05，**P＜0.01 vs respective nisin groups（without NAC pretreatment）.圖3 NAC抑制nisin對(duì)MG63細(xì)胞的促凋亡作用

Figure 4.NAC reduced ROS production caused by nisin and restored the decreased MMP in MG63 cells.A：effects of nisin（24 h）on intracellular ROS level of MG63 cells with NAC pretreatment；B：effects of nisin（24 h）on the MMP with NAC pretreatment.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs nisin group（without NAC pretreatment）.圖4 NAC降低nisin引起的MG63細(xì)胞ROS生成、恢復(fù)下降的MMP

機(jī)體在有氧代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生ROS，在正常的生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)生和清除系統(tǒng)處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。但在病理狀態(tài)（如糖尿?。┗蚩鼓[瘤藥物、重金屬、紫外線輻射和空氣污染物等外源因素刺激下，會(huì)誘導(dǎo)大量ROS產(chǎn)生，累積的ROS水平超過(guò)一定閾值，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激，造成生物大分子和細(xì)胞器（如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA 和線粒體等）損傷［14-18］。大量研究發(fā)現(xiàn)ROS的形成和積累在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡中起著至關(guān)重要的作用［19］。線粒體是ROS 的主要來(lái)源，也是ROS 的主要攻擊目標(biāo)，ROS 大量產(chǎn)生使線粒體膜通透性改變，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，促使線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔大量開(kāi)放，細(xì)胞色素C 和凋亡誘導(dǎo)因子從線粒體內(nèi)釋放出來(lái)，最終觸發(fā)caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［20-23］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳酸鏈球菌素可顯著提高人骨肉瘤MG63 細(xì)胞ROS 的產(chǎn)生，降低線粒體膜電位，增加細(xì)胞凋亡率，在使用抗氧化劑NAC 后，乳酸鏈球菌素誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)積聚的ROS 含量降低，線粒體膜電位基本恢復(fù)正常，細(xì)胞凋亡率顯著降低，提示在乳酸鏈球菌素的作用下細(xì)胞出現(xiàn)了顯著的氧化應(yīng)激損傷。Western blot 結(jié)果顯示，經(jīng)乳酸鏈球菌素處理后，MG63 細(xì)胞的抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低，Bax/Bcl-2 的比值顯著升高，促凋亡蛋白cleaved caspase-3 的蛋白水平顯著上調(diào)，進(jìn)一步地，在聯(lián)合使用NAC 后，Bcl-2 表達(dá)水平提高，Bax/Bcl-2的比值顯著降低，cleaved caspase-3 的蛋白水平顯著下降。由此，本研究推測(cè)，乳酸鏈球菌素可能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞氧化應(yīng)激、激活線粒體凋亡通路而發(fā)揮抗腫瘤作用。

綜上所述，乳酸鏈球菌素可有效降低人骨肉瘤MG63 細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，此作用主要與其促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS 生成引發(fā)氧化應(yīng)激作用，進(jìn)而激活線粒體凋亡通路有關(guān)。本研究為抗菌肽類藥物治療腫瘤提供了理論依據(jù)。