叢雯雯， 馮曄囡 ， 王帥星， 胡國民， 肖 晗， 司軍強(qiáng) ，4△， 張幼怡△

（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院 1新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2生理學(xué)教研室，新疆石河子832000；3北京大學(xué)第三醫(yī)院心內(nèi)科，血管醫(yī)學(xué)研究所，國家衛(wèi)生健康委心血管分子生物學(xué)與調(diào)節(jié)肽重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，分子心血管學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，心血管受體研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100191；4華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教研室，湖北武漢430030）

心肌纖維化是冠心病、高血壓、心肌病等多種心血管疾病發(fā)生心力衰竭、惡性心律失常甚至心源性猝死等嚴(yán)重并發(fā)癥的重要病理改變。心臟成纖維細(xì)胞（cardiac fibroblasts，CFs）是參與心肌纖維化的主要細(xì)胞類型。在心肌損傷等刺激時(shí)，CFs 遷移、增殖并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）蛋白，最終導(dǎo)致室壁順應(yīng)性降低，心臟舒張功能障礙［1-3］。因此，深入研究CFs 轉(zhuǎn)分化的機(jī)制及其干預(yù)靶點(diǎn)具有重要意義。本課題組前期研究已經(jīng)證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子配對盒因子6（paired box 6，PAX6）在纖維化心臟組織中表達(dá)下調(diào)，且抑制CFs 中 PAX6 的表達(dá)能夠引起 CFs 的轉(zhuǎn)分化［4］。這一結(jié)果提示，內(nèi)源性PAX6 的表達(dá)對于維持CFs 的表型至關(guān)重要。然而，增加PAX6的表達(dá)是否能夠作為有效的干預(yù)方式抑制病理刺激下CFs轉(zhuǎn)分化仍不清楚。鑒于此，本研究擬通過腺病毒載體過表達(dá)PAX6的方式增加CFs 中PAX6 的表達(dá)，利用血管緊張素II（angiotensin II，Ang II）誘導(dǎo)CFs的轉(zhuǎn)分化，觀察PAX6對Ang II誘導(dǎo)的CFs轉(zhuǎn)分化的作用并探究其機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 動物

8 周齡雄性C57BL/6 小鼠購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心［許可證號為SCXK（京）2016-0010］，用于分離成年小鼠CFs。動物飼養(yǎng)和使用均完全遵照北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)相關(guān)倫理標(biāo)準(zhǔn)，批準(zhǔn)號為LA2016-018。

2 材料

過表達(dá)PAX6的腺病毒（Ad-PAX6）和對照腺病毒（Ad-GFP）購自上海漢恒生物科技有限公司；Ang II購自Sigma-Aldrich；膠原酶II 和DMEM 培養(yǎng)液購自Gibco；胎牛血清購自Ausbian；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega；TRIzol、Hoechst 33342 和 Alexa Fluor?568 偶聯(lián)的熒光II抗購自Invitrogen；抗PAX6抗體、抗α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗體、抗轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor β1，TGFβ1）抗體和抗纖連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）抗體購自Abcam；抗 I 型膠原（collagen type I，Col I）抗體購自MD Bioproducts；抗 GAPDH 抗體購自 Cell Signaling Technology；山羊抗兔IgG（H+L）II抗購自中杉金橋公司。

3 方法

3.1 成年小鼠CFs 的分離與培養(yǎng) 取8 周齡雄性C57BL/6小鼠，斷頸后用乙醇消毒，立即取出心臟，修剪心耳和主動脈。去除血塊后剪碎，加入酶液（0.1%膠原酶II）置于恒溫磁力攪拌器中，整個消化過程在37℃恒溫下進(jìn)行。8 min 后吸取上清液，加入等體積含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，混合均勻。重復(fù)8～10 次，直至心臟消化完全。細(xì)胞懸液以室溫1 000 r/min 離心 5 min，用 DMEM 培養(yǎng)液再洗滌 1 次，繼而用DMEM 培養(yǎng)液將細(xì)胞重懸，種于10 cm 的細(xì)胞培養(yǎng)皿中（3～4 只心臟），于37℃、5%CO2培養(yǎng)。差速貼壁2 h 后，去除未貼壁細(xì)胞，剩余已貼壁的細(xì)胞主要為成纖維細(xì)胞。通過免疫熒光標(biāo)染波形蛋白（vimentin）對分離培養(yǎng)的 CFs 進(jìn)行鑒定，vimentin 陽性的細(xì)胞比率大于92%。24 h 后更換新鮮的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，此時(shí)培養(yǎng)皿中貼壁的CFs 為P0。傳代至第2代（P2）時(shí)進(jìn)行病毒感染。

3.2 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為Ad-GFP+Ctrl組（感染Ad-GFP）、Ad-GFP+Ang II 組（感染Ad-GFP 24 h 后，加入10-6mol/L Ang II 繼續(xù)處理 24 h 或 48 h）、Ad-PAX6+Ctrl 組（感染 Ad-PAX6）和 Ad-PAX6+Ang II 組（感染Ad-PAX6 24 h 后，加入 10-6mol/L Ang II 繼續(xù)處理 24 h或48 h）。

3.3 病毒感染 待P2 的CFs 融合度達(dá)到50%～60%時(shí)，更換為無血清培養(yǎng)液，分別加入Ad-GFP 和Ad-PAX6，以感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為2 感染6～8 h，再更換為完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至24 h和48 h。采用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞綠色熒光強(qiáng)度；采用qPCR和Western blot檢測PAX6表達(dá)情況。

3.4 Western blot 收集各組細(xì)胞，用BCA法檢測蛋白濃度，取等質(zhì)量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF 膜，用TBST 配制的5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入1∶2 000 稀釋的兔抗PAX6、Col I、FN、α-SMA 和TGFβ1 抗體，4℃搖床孵育過夜。次日TBST 洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的II 抗，室溫孵育1 h，使用GeneSys 機(jī)器ECL 發(fā)光成像。用ImageJ 圖像分析軟件對每個條帶的灰度值進(jìn)行定量分析。

3.5 固定細(xì)胞免疫熒光技術(shù) 用4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞 20 min，PBS 洗 3 次后，Triton X-100 室溫破膜20 min，再用PBS洗3次；加入1%牛血清白蛋白室溫封閉30 min；加入Ⅰ抗于4℃孵育過夜；次日PBS洗 3 次后，加入 Alexa Fluor?568 偶聯(lián)的熒光 II 抗 4℃孵育 1 h，PBS 洗 3 次；Hoechst 33342 染細(xì)胞核 6 min。之后利用高內(nèi)涵顯微鏡觀察制備好的樣品。利用高內(nèi)涵顯微鏡Array Scan 系統(tǒng)采集各通道熒光，根據(jù)細(xì)胞核計(jì)數(shù)并圈畫熒光統(tǒng)計(jì)面積。結(jié)果表示為平均熒光強(qiáng)度，即為單個細(xì)胞單位面積的熒光強(qiáng)度。

3.6 qPCR 用Trizol 試劑提取細(xì)胞樣品總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行qPCR 檢測。以GAPDH 為內(nèi)參照，通過2-ΔΔCt法比較目的基因的表達(dá)差異。引物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成，序列見表1。

表1 qPCR引物序列Table 1.Sequences of the primers for qPCR

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）或雙因素方差分析（two-way ANOVA），多重比較采用 Tukey 檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Ad-PAX6感染CFs后PAX6過表達(dá)效果驗(yàn)證

過表達(dá)小鼠PAX6 腺病毒的結(jié)構(gòu)示意圖見圖1A。感染48 h 后，倒置熒光顯微鏡下觀察，在感染Ad-GFP 和Ad-PAX6 的大部分細(xì)胞內(nèi)均可見綠色熒光，且兩組細(xì)胞的形態(tài)無明顯異常，見圖1B。qPCR和Western blot 檢測結(jié)果顯示，與未感染的對照組和感染對照病毒的Ad-GFP 組相比，感染過表達(dá)PAX6腺病毒的 Ad-PAX6 組 CFs 中 PAX6 的 mRNA 和蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01），見圖1C、D。

2 過表達(dá)PAX6 抑制CFs 中Ang II 引起的肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA的表達(dá)

Western blot 結(jié)果顯示，在感染Ad-GFP 的CFs中，Ang II 處理能夠增加肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA的表達(dá)（P＜0.01）；而在感染Ad-PAX6的CFs中，Ang II 處理組與對照組相比，α-SMA 的表達(dá)無顯著變化（P＞0.05）；與 Ad-GFP+Ang II 組相比，Ad-PAX6+Ang II 組α-SMA 表達(dá)顯著降低（P＜0.01），見圖2A。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果同樣顯示，對感染Ad-GFP的CFs 給予Ang II 刺激，α-SMA 的平均熒光強(qiáng)度顯著增加（P＜0.01）；而對感染 Ad-PAX6 的 CFs 給予Ang II刺激，α-SMA 的平均熒光強(qiáng)度無顯著變化（P＞0.05）；與 Ad-GFP+Ang II 組相比，Ad-PAX6+Ang II組α-SMA 的平均熒光強(qiáng)度顯著降低（P＜0.05），見圖2B。

3 過表達(dá) PAX6 抑制 CFs 中 Ang II 引起的 ECM 蛋白的表達(dá)與分泌

Western blot 結(jié)果顯示，在感染對照病毒Ad-GFP的CFs 中，Ang II 處理能夠顯著增加ECM 蛋白Col I（P＜0.01）和 FN（P＜0.05）的表達(dá)；而在感染 Ad-PAX6 的CFs 中，Ang II 處理組與對照組相比，Col I和FN 的表達(dá)無顯著變化；Ad-PAX6+Ang II 組細(xì)胞中Col I（P＜0.01）和FN（P＜0.05）的表達(dá)較Ad-GFP+Ang II 組顯著降低，見圖3A、B。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果同樣顯示，對感染Ad-GFP 的CFs 給予Ang II 刺激，Col I和FN的平均熒光強(qiáng)度均顯著增加（P＜0.01）；而對感染 Ad-PAX6 的 CFs 給予 Ang II 刺激，Col I 和 FN平均熒光強(qiáng)度無顯著變化（P＞0.05）；Ad-PAX6+Ang II組 Col I 和 FN 平均熒光強(qiáng)度較 Ad-GFP+Ang II 組顯著降低（P＜0.01），見圖3C、D。

Figure 1.Verification of PAX6 overexpression in CFs.A：the structure schematic of the adenovirus engineered to overexpress mouse PAX6；B：fluorescence observation for the adenovirus infection efficiency after 48 h（scale bar=200 μm）；C：the mRNA expression of PAX6 detected by qPCR；D：the protein expression of PAX6 detected by Western blot.Mean±SEM. n=5～6.**P＜0.01 vs control（Ctrl）group and Ad-GFP group.圖1 腺病毒Ad-PAX6轉(zhuǎn)染CFs后PAX6過表達(dá)效果驗(yàn)證

Figure 2.Overexpression of PAX6 inhibited Ang II-induced α-SMA expression in CFs.A：the protein level of α-SMA detected by Western blot；B：representative images of immunofluorescence staining（scale bar =150 μm）and average fluorescence intensity of α-SMA.Mean±SEM. n=6.**P＜0.01 vs Ad-GFP+Ctrl group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs Ad-GFP+Ang II group.圖2 過表達(dá)PAX6抑制CFs中Ang II誘導(dǎo)的α-SMA表達(dá)

4 過表達(dá) PAX6 抑制 CFs 中 Ang II 引起的 TGFβ1表達(dá)

qPCR和Western blot結(jié)果顯示，在感染對照病毒Ad-GFP 后給予 Ang II 刺激，CFs 中 TGFβ1 的 mRNA（P＜0.01）及蛋白（P＜0.05）水平顯著升高；而在感染Ad-PAX6 后給予 Ang II 刺激，TGFβ1 的 mRNA 及蛋白水平無顯著變化（P＞0.05）；同時(shí)，Ad-PAX6+Ang II組TGFβ1 的mRNA（P＜0.01）及蛋白（P＜0.05）水平較Ad-GFP+Ang II組顯著降低，見圖4。

Figure 3 Overexpression of PAX6 inhibited Ang II-induced collagen type I（Col I）and fibronectin（FN）synthesis in CFs.A，B：the protein expression of Col I and FN detected by Western blot；C，D：representative images of immunofluorescence staining（scale bar =150 μm）and average fluorescence intensity of Col I and FN.Mean±SEM. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs Ad-GFP+Ctrl group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs Ad-GFP+Ang II group.圖3 過表達(dá)PAX6抑制CFs中Ang II誘導(dǎo)的Ⅰ型膠原和纖連蛋白的合成

討 論

本研究結(jié)果表明，過表達(dá)PAX6 可以抑制Ang II誘導(dǎo)的CFs 轉(zhuǎn)分化及ECM 蛋白的表達(dá)與分泌，這一作用可能是通過抑制TGFβ1 表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的（圖5）。因此本研究結(jié)果提示，增加PAX6表達(dá)可以發(fā)揮抗心肌纖維化的作用。

PAX6 是配對盒因子家族中的一員，在視網(wǎng)膜形成及其他眼組織發(fā)育與疾病中發(fā)揮關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用［5］。除此之外，PAX6 在腦神經(jīng)系統(tǒng)、胰腺及多種腫瘤中均已有深入研究。PAX6 基因突變將導(dǎo)致前腦、鼻結(jié)構(gòu)以及胰島的發(fā)育與形態(tài)異常［6-7］。PAX6啟動子區(qū)的甲基化與膀胱癌、非小細(xì)胞肺癌等癌癥的復(fù)發(fā)與低生存率正相關(guān)［8-9］。然而目前PAX6 在心臟疾病中的相關(guān)研究較少，有研究利用轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析和蛋白質(zhì)/DNA 陣列分析的方法，發(fā)現(xiàn)PAX6 的DNA 結(jié)合活性在病理性心肌肥厚中顯著高于生理性心肌肥厚［10］，提示PAX6可能參與調(diào)控病理性心肌肥厚過程。我們之前的研究表明抑制內(nèi)源性PAX6的表達(dá)能夠促進(jìn)CFs轉(zhuǎn)分化［4］。但是一些研究表明，過高或過低的PAX6表達(dá)水平均可產(chǎn)生病理效應(yīng)。例如，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞中PAX6表達(dá)水平的增加和降低均抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖［11-12］。因此有必要進(jìn)一步明確過表達(dá)PAX6對心臟CFs 轉(zhuǎn)分化的調(diào)控作用。在本研究中，我們利用腺病毒載體過表達(dá)PAX6以增加CFs中PAX6的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PAX6 并不引起正常CFs 的轉(zhuǎn)分化，而是抑制病理刺激（Ang II）引起的CFs 轉(zhuǎn)分化。因此，我們的研究表明維持CFs 中PAX6 的高表達(dá)對抑制心肌纖維化具有重要意義。

Figure 4.Overexpression of PAX6 inhibited Ang II-induced TGFβ1 expression in CFs.A：the mRNA expression of TGFβ1 detected by qPCR；B：the protein expression of TGFβ1 detected by Western blot.Mean±SEM. n=5～6. *P＜0.05，**P＜0.01 vs Ad-GFP+Ctrl group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs Ad-GFP+Ang II group.圖4 過表達(dá)PAX6抑制Ang II誘導(dǎo)的CFs中TGFβ1的表達(dá)

Figure 5.A schematic model describing how paired box 6（PAX6）inhibits angiotensin II（Ang II）-induced cardiac fibroblast（CF）transdifferentiation.Transforming growth factor β1（TGFβ1）induces CF transdifferentiation and extracellular matrix synthesis.Our study indicates that PAX6 inhibits Ang II-induced CF transdifferentiation by inhibiting TGFβ1 expression.圖5 PAX6抑制Ang II誘導(dǎo)CFs轉(zhuǎn)分化的模式圖

本研究利用Ang II 誘導(dǎo)CFs 轉(zhuǎn)分化，構(gòu)建CFs 的轉(zhuǎn)分化模型，闡明了PAX6 對Ang II 誘導(dǎo)的CFs 轉(zhuǎn)分化發(fā)揮抑制作用。但值得注意的是，在肝星狀細(xì)胞中的一項(xiàng)最新研究表明，PAX6對肝臟纖維化起促進(jìn)作用［11］。肝星狀細(xì)胞的激活是肝臟纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。該研究發(fā)現(xiàn)，PAX6 促進(jìn)GLI1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，介導(dǎo)肝星狀細(xì)胞的激活與增殖［13］。對于PAX6 在心臟和肝臟中功能的差異，我們認(rèn)為可能是由于PAX6對多種病理過程的調(diào)控具有組織特異性。例如，在間腦和大腦皮層中，轉(zhuǎn)錄因子PAX6以相反的方向轉(zhuǎn)錄調(diào)控細(xì)胞增殖與分化的平衡。而造成這一差異的原因是大腦皮層存在另一轉(zhuǎn)錄因子Foxg1，敲除大腦皮層中Foxg1的表達(dá)則可逆轉(zhuǎn)PAX6 對腦皮層細(xì)胞增殖與分化的調(diào)控作用［14］。另外，在不同的腫瘤組織中，PAX6也會發(fā)揮不同的促癌或抑癌作用［15-17］。由此我們推斷，由于心臟和肝臟中存在不同轉(zhuǎn)錄因子與PAX6 相互作用，共同影響纖維化的進(jìn)程，因而導(dǎo)致PAX6在肝臟中發(fā)揮促纖維化作用，而在心臟中則表現(xiàn)為抗纖維化作用。

TGFβ1 是調(diào)控心肌纖維化的關(guān)鍵細(xì)胞因子。TGFβ1 促進(jìn)CFs 轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，其下游信號分子Smad3 進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，介導(dǎo)Col I、Col III、FN 等多種 ECM 蛋白的轉(zhuǎn)錄表達(dá)［18］。我們前期研究和其他研究表明，Ang II 可以通過轉(zhuǎn)錄因子 AP-1 與 HNF-4α 直接促進(jìn) TGFβ1 的表達(dá)［19-20］，還能夠通過調(diào)控microRNA 間接促進(jìn)TGFβ1 的表達(dá)［21］。我們之前的研究發(fā)現(xiàn) Ang II 可下調(diào) CFs 中PAX6 的表達(dá)水平［4］。而在本研究中，通過外源性增強(qiáng) PAX6 的表達(dá)能夠抑制 Ang II 誘導(dǎo)的 TGFβ1 的mRNA 和蛋白表達(dá)。因此，本研究提出了PAX6 過表達(dá)抑制心臟CFs 轉(zhuǎn)分化的機(jī)制可能是通過抑制AngII 引起的TGFβ1 表達(dá)增加。鑒于PAX6 能夠與Tgfb1內(nèi)含子特定區(qū)域結(jié)合并發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用［2］，過表達(dá)PAX6 抑制TGFβ1 表達(dá)這一干預(yù)方式可能不僅局限于Ang II 模型，而是適用于所有TGFβ1 表達(dá)升高的心肌纖維化環(huán)境，為未來干預(yù)心肌纖維化提供了新思路。

綜上所述，本研究進(jìn)一步證實(shí)PAX6對心肌纖維化起保護(hù)作用。外源性增加PAX6 的表達(dá)能夠作為有效的干預(yù)方式抑制TGFβ1 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而抑制Ang II誘導(dǎo)的CFs轉(zhuǎn)分化及ECM蛋白的表達(dá)與分泌。本研究為心肌纖維化的預(yù)防與治療提供了新的思路與實(shí)驗(yàn)證據(jù)。