吉潔 ，徐新榮，王富強(qiáng)，周春剛，唐苗苗，唐穎，王榮榮，程立

在多種眼底疾病如病理性近視、年齡相關(guān)性黃斑變性、眼組織胞漿菌病等中常發(fā)生脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)，嚴(yán)重影響患者視功能，造成脈絡(luò)膜滲出、出血，嚴(yán)重者可導(dǎo)致視力下降[1]。目前治療藥物主要為血管內(nèi)皮生長因子拮抗劑以及類固醇類抗炎藥，臨床療效雖好，但由于藥物會(huì)升高眼壓，需多次注射，給患者治療帶來巨大的經(jīng)濟(jì)壓力。因此，尋找安全有效藥物是目前治療CNV 的重要任務(wù)[2]。袖皮素(naringenin，Nar)屬于二氫黃酮化合物，其能夠抑制CNV，但袖皮素單體在水中溶解度不高，生物活性低。近期研究[3]顯示袖皮素與磷脂結(jié)合后改善單體理化性質(zhì),有效提高天然活性成分的體內(nèi)吸收，提高其生物利用度。本研究通過制備脈絡(luò)膜新生血管大鼠模型，給予袖皮素磷脂復(fù)合物(naringenin phospholipid complex，NPC)治療，應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽(tandem mass tags，TMT)技術(shù)比較模型組和NPC 治療組CNV 組織中蛋白質(zhì)表達(dá)差異，同時(shí)對(duì)蛋白表達(dá)譜進(jìn)行生物學(xué)分析，以探究其對(duì)CNV的抑制作用以及可能的機(jī)制，為該病治療提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Brown Norway(BN)大鼠，雄性，SPF 級(jí)，體重200～220 g，由北京維通利華動(dòng)物技術(shù)有限公司提供[SCXK(京)2015-0012]，所有大鼠均在恒定25℃，濕度為50%的環(huán)境中，每天光照12 h(8：00～20：00)，自由飲水?dāng)z食。

1.2 儀器與試劑

Thermo Scientific Co.Q Exactive Orbitrap (LCMS/MS)；戴安納升高效液相色譜儀(美國賽默飛世爾科技公司，LC)；島津高效液相色譜儀 (日本，LC20A)；布魯克Ultraflex; Tanon 電泳槽(中國上海力敏實(shí)業(yè)有限公司，VE-186)；UMAX Powerlook 2100XL-USB 掃描儀(中國世群國際)；IKA 振蕩器；恒溫加熱塊(鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司)；DYY-7C型電泳儀(北京六一儀器廠)；LX-100 手掌式離心機(jī)(其林貝爾儀器)；離心(eppendorf centrifuge 5417R型)；電熱恒溫水浴鍋(長安科學(xué)儀器);尿素(Gibco-BRL 公司)；CHAPS(Calbiochem 公司)；碘乙酰胺(IAM)(Promega 公司)；丙烯酰胺(SIGMA 公司)；二硫素糖醇(DTT)(Promega 公司)；SDS(SIGMA 公司)；過硫酸胺(AMRECSO)；甲叉雙丙烯酰胺(SIGMA 公司)；N,N,N’,N-四甲基乙烯二胺 (TEMED)(SIGMA公司)；溴酚藍(lán)(SIGMA 公司)；SCX 強(qiáng)陽離子交換柱(phenomenex Luna SCX 100A)；strata-X C18 除鹽柱(phenomenex)。

1.3 動(dòng)物模型及藥物制備

1.3.1 大鼠CNV 模型制備 健康雄性BN 大鼠在造模前禁食12 h，10%水合氯醛(0.3 ml/kg)腹腔注射麻醉動(dòng)物，用新福林與0.5%托吡卡胺混合散瞳劑充分散瞳，采用氪黃激光(參數(shù)：光斑直徑100 μm，曝光時(shí)間0.1 s,功率150～200 mW)，用專用前置鏡(120 D)，分別在左右眼的視網(wǎng)膜大血管間光凝8 個(gè)點(diǎn)，激光斑均圍繞視盤并距視盤2～4 個(gè)視盤直徑，光凝擊破Bruch’s 膜后產(chǎn)生小氣泡為合格光凝點(diǎn)。將視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜或玻璃體有出血的大鼠剔除，造模成功后待大鼠麻醉蘇醒送回SPF 飼養(yǎng)箱。

1.3.2 NPC 制備 將質(zhì)量濃度為5 g/L 的袖皮素溶解于適量無水乙醇中，按照袖皮素和大豆磷脂1:2的質(zhì)量比加入大豆磷脂，加溫至60℃，恒溫?cái)嚢? h，使之均勻成溶液狀態(tài)。將溶液過濾，濾液經(jīng)洗滌真空干燥24 h 后得到NPC。用100 目篩研磨后置于干燥器中備用。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

模型大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組5 只，模型組5 只，NPC治療組5 只。正常對(duì)照組和模型組不給藥，NPC 治療組給藥劑量：30 mg/kg/d，為腹腔注射。視網(wǎng)膜光凝后當(dāng)天開始給藥至觀察4 周結(jié)束。

1.5 蛋白組學(xué)方法

1.5.1 蛋白質(zhì)提取 大鼠視網(wǎng)膜光凝給藥治療4 周后頸椎脫臼處死摘取眼球。眼球摘取后即刻用冰鹽水(含0.1%PMSF)沖洗,在手術(shù)顯微鏡冰浴下沿角膜緣男去角膜，小心去除晶狀體和玻璃體。放射狀男開眼杯，用虹膜復(fù)位剝離器刮取RPE-Bruch 膜-脈絡(luò)膜復(fù)合體，立即凍存于液氮中。取出保存于液氮中的標(biāo)本，室溫下從每組標(biāo)本中提取1 mgCNV 組織蛋白質(zhì),按1：7 的比例加入裂解液(7 M 尿素，2 M 硫尿)，勻漿，靜置1 h，每隔15 min 震蕩1 次，4°C 40,000 G 離心1 h，取上清，BCA 定量。每組取100 μg 蛋白，加入DTT 到濃度為10 mM。在56°C 水溫中水浴1 h。取出然后快速加入IAM 到濃度為55 mM，在暗室中靜置1 h。加入預(yù)冷丙酮，體積4 倍于樣品溶液，-20°C 沉淀超過3 h。20,000 g 于4°C 離心20 min，取出沉淀，加入復(fù)溶buffer 300 μl，最終濃度為50%TEAB，0.1%SDS。超聲助溶3 min。對(duì)肽段使用bradford 法進(jìn)行定量。

1.5.2 蛋白質(zhì)的消化 每份樣品100 μg 蛋白體積，以TEAB (含0.1%SDS) 補(bǔ)齊各份樣品體積。加入Trypsin 1 μg/μl，3.3 μg 的酶加入到每100 μg 蛋白質(zhì)底物中，以37°C 水浴24 h，Trypsin 1 μg 補(bǔ)加入。37°C下放置12 h。將消化液凍干后，每管用30 μl TEAB(水：TEAB=1:1，含0.1%SDS)復(fù)溶肽段。取1 μl，使用MALDI Tof/Tof 檢測(cè)消化后肽段的消化效率。

1.5.3 肽段的標(biāo)記 平衡標(biāo)記試劑至室溫，70 μl 異丙醇加入到每管標(biāo)記試劑中，vortex 1 min，離心甩至管底。將處理完畢的標(biāo)記試劑加入至肽段中，用不同大小的同位素標(biāo)記不同樣品。樣品各分別標(biāo)記為126、127、128、129、130、131?；靹蚝螅χ凉艿?，室溫靜置2 h。

1.5.4 HPLC(強(qiáng)陽離子交換色譜) 標(biāo)記后用A 液稀釋樣品10 倍，磷酸的pH 值調(diào)至3.0，取上清液前15,000g離心10 min。A 液成分：25%ACN，10 mMK H2PO4。B 液(pH 值3.0)成分：25%ACN，2MKCL，10 mMKH2PO4。配好A B 液后，進(jìn)行管外超聲5～10 min 后，使用有機(jī)膜(0.22 μm 或0.45 μm)過濾。先后打開機(jī)器，閥門，接著AB 泵用MilliQ 水排氣，排氣后關(guān)上閥門。用MilliQ 水對(duì)柱子進(jìn)行10 min 左右的沖洗，同時(shí)觀察壓力平衡情況。之后，A 液放入A 泵中，B 液放入B泵中，閥門打開，讓A 泵、B 泵各充滿液體。關(guān)閉閥門后用A 液平衡系統(tǒng)調(diào)B 泵至0%達(dá)10～20 min(1ml/min)，同時(shí)平衡，直到壓力和吸收峰都走平后上樣。使用進(jìn)樣針在定量環(huán)中注入樣品。扳上注射口開關(guān)，注入后再扳下開關(guān)、拔針。樣品收集后進(jìn)行平衡清洗。A 液平衡10 min 后，流速調(diào)至0，MilliQ 水中放入A 泵和B泵，閥門打開后沖泵。沖洗到吸收峰、壓力走平后，沖甲醇，關(guān)閉閥門。

1.5.5 肽段的純化(C18 反相色譜除鹽) 甲醇1ml 活化柱料，流速2-3 滴/s，5%ACN1 滴/s 進(jìn)行平衡，用MilliQ水1ml 對(duì)樣品溶解過柱。用5%乙腈1ml 以1 滴/s 洗柱除鹽，以流速1 滴/s 將純乙腈2500 μl 洗脫。低溫離心后將乙腈抽干，然后以0.1%甲酸復(fù)溶肽段。

1.5.6 質(zhì)譜檢測(cè)、蛋白質(zhì)定性與定量分析使用高精度液質(zhì)聯(lián)用型質(zhì)譜(Thermo-fisherQ-Exactive-Orbitrap)檢測(cè)肽段信號(hào)，然后得出蛋白定性定量結(jié)果。掃描質(zhì)譜完成后得到質(zhì)譜信號(hào)總圖，再將之轉(zhuǎn)換為mgf 文件。應(yīng)用Mascot 軟件(MASCOT 2.3.01)進(jìn)行定性檢索與定量分析。肽段相對(duì)定量根據(jù)離子的相對(duì)豐度，蛋白的相對(duì)定量結(jié)果根據(jù)肽段相對(duì)定量結(jié)果統(tǒng)計(jì)得出。差異蛋白質(zhì)的篩選標(biāo)準(zhǔn)：同一蛋白在某一組相對(duì)于另一組的比值大于1.3 倍(上調(diào))或小于-1.3 倍(下調(diào))，且P＜0.05。通過檢索數(shù)據(jù)庫Gene Ontology Database，對(duì)最終鑒定出的蛋白質(zhì)進(jìn)行GO功能注釋。

2 結(jié)果

2.1 鑒定蛋白質(zhì)及差異表達(dá)蛋白

同位素峰面積應(yīng)用Mascot 軟件中Scaffold 算法進(jìn)行計(jì)算，CNV 組織中的蛋白質(zhì)鑒定和相對(duì)定量通過檢索Swissprot_human 數(shù)據(jù)庫完成。最終鑒定特有肽段序列10819 個(gè)，鑒定得出蛋白質(zhì)2717 個(gè)。比較了模型組與NPC 組的差異表達(dá)蛋白質(zhì)。相對(duì)于模型組，在NPC 組中蛋白質(zhì)上調(diào)或下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)一致的差異蛋白共有113 個(gè)，其中上調(diào)蛋白質(zhì)57 個(gè)，下調(diào)蛋白質(zhì)56 個(gè)(表1)。模型組與正常對(duì)照組上調(diào)或下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)一致的差異蛋白共有314 個(gè)，其中上調(diào)蛋白質(zhì)202 個(gè)，下調(diào)蛋白質(zhì)112 個(gè)(表2)。袖皮素磷脂復(fù)合物組與正常對(duì)照組上調(diào)或下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)一致的差異蛋白共有90 個(gè)，其中上調(diào)蛋白質(zhì)22 個(gè)，下調(diào)蛋白質(zhì)68 個(gè)(表3)。

表1 模型組與NPC 組之間的差異表達(dá)蛋白質(zhì)

2.2 生物信息學(xué)分析

GO(gene ontology)注釋：通過檢索數(shù)據(jù)庫Gene Ontology Database (參見其網(wǎng)站http://www.geneontology.org/)，初步分析篩查所得的蛋白質(zhì)所參與的生物過程、分子功能、細(xì)胞組分。蛋白質(zhì)的功能注釋采用了BLAST2GO(參見其主頁http://www.blast2go.com/b2ghome) 來進(jìn)行。結(jié)果顯示:這些蛋白主要在24 種生物學(xué)過程中發(fā)揮作用，包括細(xì)胞殺傷、免疫系統(tǒng)過程、細(xì)胞粘附、代謝過程、細(xì)胞增殖、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、生殖過程、信號(hào)傳遞、多細(xì)胞生物過程、刺激應(yīng)答、生物調(diào)節(jié)、多生物進(jìn)程、定位、細(xì)胞解毒作用等(表4)；4 種細(xì)胞組分被包含其中，包括細(xì)胞內(nèi)的、細(xì)胞、蛋白復(fù)合體、細(xì)胞結(jié)構(gòu)實(shí)體等(表5)；與13 類分子功能緊密相關(guān)，包括結(jié)合、催化活性、結(jié)構(gòu)分子活性、轉(zhuǎn)運(yùn)活性、分子功能調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性、抗氧化活性、翻譯調(diào)節(jié)活性、信號(hào)受體活性、鈣離子傳感器活性等(表6)。

表2 模型組與對(duì)照組之間的差異表達(dá)蛋白質(zhì)

表3 NPC 組與對(duì)照組之間的差異表達(dá)

表4 差異蛋白生物學(xué)過程分類分析

表5 差異蛋白生物學(xué)過程分類分析

表6 差異蛋白生物學(xué)過程分類分析

3 討論

脈絡(luò)膜新生血管發(fā)生涉及多因素，包括高齡、吸煙、高血壓、心血管疾病等，而其具體發(fā)病機(jī)制目前尚未明確，多數(shù)研究認(rèn)為VEGF 異常、Bruch’s 膜受損與其發(fā)生密切相關(guān)[4]。近年來,中藥逐漸成為抑制眼部新生血管治療的熱點(diǎn)，其安全性高，價(jià)格便宜，尤其是黃酮類藥物，如袖皮素、人參皂苷、鈍頂螺旋藻多糖提取物等有強(qiáng)抑制眼部新生血管作用。袖皮素存在于胡袖皮、檸檬、枳殼、橘子等，具有抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗氧化、抗癌等功效。動(dòng)物研究[5]顯示，其能夠抑制脈絡(luò)膜血流，并通過抑制體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，緩解CNV 形成。但其水溶性差，生物利用率低。研究[6-7]報(bào)道天然黃酮類物質(zhì)與磷脂具有特殊的親和力，可在一定條件下形成復(fù)合物，并能增強(qiáng)母體的生物、藥理活性。課題組前期研究結(jié)果也顯示NPC 治療組CNV 面積和熒光滲透顯著低于袖皮素治療組，NPC 治療組對(duì)NF-κB、iNOS、VEGF、COX-2、MMP-2、MMP-9 表達(dá)的抑制作用優(yōu)于袖皮素組，表明NPC 的生物活性較袖皮素顯著提高，抑制脈絡(luò)膜新生血管的效果優(yōu)于Naringenin[8]。

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用為研究疾病發(fā)病機(jī)制、尋找適宜的生物標(biāo)志物提供了可能[9]。1994 年，Wilkins 與Williams 首次提出蛋白質(zhì)組(Proteome)的概念，它意指“一種基因組所表達(dá)的全套蛋白質(zhì)”，源于蛋白質(zhì)(protein)與基因組(genome)兩個(gè)詞的組合。即指在某個(gè)時(shí)間和空間內(nèi)，一種生物、一種組織或一種細(xì)胞所表達(dá)的所有亞型以及所有經(jīng)過修飾的全部蛋白質(zhì)[10]。Wei Q 等[11]對(duì)伴有脈絡(luò)膜新生血管的病理性近視視網(wǎng)膜劈裂患者的玻璃體液進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞粘合、蛋白酶抑制劑、促血管生長因子、抗血管生長因子等28 種蛋白，康柏西普眼內(nèi)注射組相比對(duì)照組明顯下調(diào)，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白明顯上調(diào)。

生物質(zhì)譜技術(shù)快速發(fā)展，具有高靈敏度、高通量和大動(dòng)態(tài)范圍等優(yōu)勢(shì)，在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中二維凝膠電泳技術(shù)逐步被取代，質(zhì)譜技術(shù)成為現(xiàn)在的主流技術(shù)。TMT 技術(shù)是一種對(duì)多肽末端和側(cè)鏈的氨基基團(tuán)進(jìn)行特異性標(biāo)記的體外標(biāo)記技術(shù)。具有相當(dāng)高的通量，在串聯(lián)質(zhì)譜分析的基礎(chǔ)上，2 組、6 組甚或10組不同樣品中蛋白質(zhì)的相對(duì)含量可同時(shí)比較。并且可以廣泛應(yīng)用于對(duì)細(xì)胞、組織等的樣品標(biāo)記，標(biāo)記率高，反應(yīng)速度快，被廣泛用于特殊功能蛋白質(zhì)篩選、疾病發(fā)病機(jī)制研究、疾病標(biāo)志物篩選、藥物作用靶點(diǎn)研究等。2018 年Ming Wang 等[12]利用TMT 標(biāo)記食管鱗狀腫瘤細(xì)胞 (ESCC)，用定量蛋白酶激活受體4(PAR4)在食管鱗狀腫瘤細(xì)胞中的抑癌作用。本次試驗(yàn)采用6 標(biāo)TMT 試劑，其中包括6 種等量的同位素試劑，能夠標(biāo)記蛋白質(zhì)酶解后的肽段，從而通過串聯(lián)質(zhì)譜方法，對(duì)肽段進(jìn)行精確鑒定和定量。

在本研究中，對(duì)模型組、NPC 組大鼠CNV 組織和正常對(duì)照組大鼠脈絡(luò)膜組織進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定，最終鑒定到特有肽段序列10819 個(gè)，蛋白質(zhì)2717 個(gè)。比較模型組和NPC 組、模型組和正常對(duì)照組、NPC組和正常對(duì)照組，差異表達(dá)蛋白分別為113 個(gè)(上調(diào)蛋白質(zhì)57 個(gè)，下調(diào)蛋白質(zhì)56 個(gè))、314 個(gè)(上調(diào)蛋白質(zhì)202 個(gè)，下調(diào)蛋白質(zhì)112 個(gè))、90 個(gè)(上調(diào)蛋白質(zhì)22 個(gè)，下調(diào)蛋白質(zhì)68 個(gè))。通過檢索數(shù)據(jù)庫Gene Ontology Database 進(jìn)行搜索，對(duì)篩查到的差異蛋白質(zhì)所參與的生物過程、分子功能、細(xì)胞組分進(jìn)行了初步分析。生物信息學(xué)分析表明，差異蛋白主要參與24 種生物學(xué)過程、4 種細(xì)胞組分和13 類分子功能。主要功能集中在結(jié)合作用、抗氧化活性、催化活性、轉(zhuǎn)運(yùn)活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等。本次研究為闡明NPC 對(duì)脈絡(luò)膜新生血管的作用機(jī)制打下了基礎(chǔ)。今后還將進(jìn)一步進(jìn)行差異蛋白KEGG 通路分析、相互作用節(jié)點(diǎn)中心蛋白的驗(yàn)證，以進(jìn)一步研究具體作用機(jī)制。