高偉霞，秦小菀，劉 陽，張 靖，丁顯春

（1.南陽市中心醫(yī)院急診兒科，河南 南陽 473009；2.南陽市中心醫(yī)院兒科一病區(qū)，河南 南陽 473009；3.南陽市中心醫(yī)院新生兒科，河南 南陽 473009；4.南陽市中心醫(yī)院兒科三病區(qū)，河南 南陽 473009）

支氣管哮喘是一種常見呼吸道慢性病，以慢性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性為特征，病情遷延、反復(fù)發(fā)作、難以根治[1]，極大地影響了患兒健康，甚至危及生命，給社會和家庭帶來嚴(yán)重負(fù)擔(dān)。嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等多種炎性細(xì)胞和細(xì)胞因子，以及免疫功能失衡在兒童支氣管哮喘發(fā)病過程中起重要作用。T淋巴細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白-3（T cell immunoglobulin and mucin 3，Tim-3）mRNA已被證實為哮喘易感基因，特異性表達(dá)于活化的輔助性T細(xì)胞（T helper cell，Th）1及Th17表面，在慢性病毒感染、自身免疫性疾病及變態(tài)反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，Tim-3 mRNA具有調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞平衡的作用，而Th1/Th2細(xì)胞的功能失衡是引發(fā)支氣管哮喘的重要原因[2-3]。目前，對于兒童支氣管哮喘與炎癥反應(yīng)關(guān)系的報道較多，但對于誘導(dǎo)痰中炎性細(xì)胞類型及炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的報道相對較少。本研究通過檢測支氣管哮喘患兒誘導(dǎo)痰中炎性細(xì)胞類型、Tim-3 mRNA以及白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-2、IL-4、IL-10、IL-13和干擾素γ（interferon gamma，IFN-γ）等多種炎癥相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平，分析其對兒童支氣管哮喘病情監(jiān)測、療效評估以及與兒童支氣管炎（不合并哮喘）的鑒別診斷價值，以期為兒童支氣管哮喘的治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2017年3月—2019年4月南陽市中心醫(yī)院54例支氣管哮喘患兒（研究組），其中男童29例（1～6歲18例、7～14歲11例），女童25例（1～6歲13例、7～14歲12例）。所有入選患兒均符合兒童支氣管哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。按哮喘發(fā)作期嚴(yán)重程度將研究組患兒分為輕度哮喘組（14例）、中度哮喘組（24全例）、重度哮喘組（16例）。選取同期在南陽市中心醫(yī)院接受治療的年齡相當(dāng)?shù)闹夤芊窝祝ú缓喜⑾┗純?2例作為對照組，其中男童23例（1～6歲12例、7～14歲11例）、女童19例（1～6歲11例，7～14歲9例）。2個組患兒在年齡、性別方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

所有研究對象入選標(biāo)準(zhǔn)：年齡1～14歲，患兒家屬知情同意，通過南陽市中心醫(yī)院倫理委員會審批，患兒近6個月內(nèi)無糖皮質(zhì)激素治療史，無心、肝、腎等重要臟器疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：有重要臟器及器質(zhì)性病變者有糖皮質(zhì)激素治療史者，精神疾病者。

1.2 治療方案

對照組給予常規(guī)綜合治療，包括止咳化痰、退熱、抗感染、補液治療等，另給予喜炎平聯(lián)合布地奈德超聲霧化治療，具體方法為：喜炎平（25 mg/次）+布地奈德混懸液1 mL（含布地奈德0.5 mg）+0.9%氯化鈉溶液3 mL，超聲霧化吸入10 min。所有患兒根據(jù)具體情況進(jìn)行祛痰、吸氧、解除痙攣、抗感染等對癥治療，吸入用布地奈德混懸液4 mL（英國AstraZeneca公司，批號為LOT330452）、硫酸特布他林霧化液2 mL（英國AstraZeneca公司，批號為BBCT），每日2次，每次面罩吸入時間為15 min，氧流量為4～5 L/min。

1.3 誘導(dǎo)痰的收集與處理

以3%高滲氯化鈉溶液對受試對象進(jìn)行15 min霧化，然后用礦泉水漱口至咳出痰液，將痰液收集至消毒平皿中，于4 ℃保存?zhèn)溆?。將透明且密度較高的痰液放入Eppendorf管中稱重，并加入4倍體積、0.1%二硫蘇糖醇試劑（DL-dithiothreitol，DTT），震蕩10 min充分混勻，然后37 ℃水浴10 min，經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾雜質(zhì)，以450×g離心12 min，將上清液置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。沉淀的?xì)胞用于細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查和Tim-3 mRNA檢測。

1.4 方法

1.4.1Tim-3 mRNA水平檢測 采用RNA抽提試劑盒（北京安圖生公司）提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增后，將擴增產(chǎn)物置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。PCR擴增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性20 s，56 ℃退火40 s并延伸30 s，重復(fù)39個循環(huán)；重復(fù)3次，取平均值。

1.4.2 IL-2、IL-4、IL-10、IL-13、IFN-γ水平檢測 將誘導(dǎo)痰上清液嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒（美國R&D公司）說明書進(jìn)行操作，使用Sun-rise酶標(biāo)儀（奧地利Tecan公司）檢測各炎癥相關(guān)因子水平。

1.4.3 炎性細(xì)胞檢測 使用Olympus BX53顯微鏡（日本Olympus公司）檢測各種炎性細(xì)胞，并計算其百分比。

1.5 療效評定標(biāo)準(zhǔn)[5]

療效分為顯效、有效、無效。顯效指咳嗽、喘憋、氣促等哮喘癥狀明顯緩解，第1秒最大呼氣量（forced expiratory volume in 1 second，F(xiàn)EV1）增加率≥25%；有效指哮喘癥狀有所緩解，肺部哮鳴音和濕啰音基本消失，F(xiàn)EV1增加率為15%～24%；無效指未達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料采用±s表示，組間比較使用t檢驗；計數(shù)資料用例（率）表示，組間比較采用χ2檢驗；相關(guān)性分析使用Pearson相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療前各組誘導(dǎo)痰中炎性細(xì)胞類別、Tim-3 mRNA以及炎癥相關(guān)細(xì)胞因子比較

治療前，研究組誘導(dǎo)痰中嗜酸性粒細(xì)胞百分比、淋巴細(xì)胞百分比、Tim-3 mRNA、IL-4、IL-13、IFN-γ水平及IFN-γ/IL-10比值均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；IL-2、IL-10及Th1/Th2均低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 不同嚴(yán)重程度哮喘患兒誘導(dǎo)痰中Tim-3 mRNA和炎癥相關(guān)細(xì)胞因子水平比較

中度哮喘組、重度哮喘組患兒嗜酸性粒細(xì)胞百分比、中性粒細(xì)胞百分比、淋巴細(xì)胞百分比、Tim-3 mRNA、IL-4、IL-13、IFN-γ水平及IFN-γ/IL-10高于輕度哮喘組、對照組患兒，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而IL-2、IL-10、IFN-γ水平及Th1/Th2低于輕度哮喘組和對照組患兒，差異有統(tǒng)計學(xué)意義細(xì)胞（P＜0.05）。見表1。

表1 不同嚴(yán)重程度哮喘患兒誘導(dǎo)痰中炎性細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子水平比較 ±s

表1 不同嚴(yán)重程度哮喘患兒誘導(dǎo)痰中炎性細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子水平比較 ±s

注：與對照組比較，*P＜0.05；與輕度哮喘組比較，#P＜0.05；與中度哮喘組比較，△P＜0.05。

組別 嗜酸性粒細(xì)胞百分比/%中性粒細(xì)胞百分比/%單核細(xì)胞百分比/%淋巴細(xì)胞百分比/%Tim-3 mRNA IL-4/（pg/mL）對照組 8.86±1.39 50.85±8.22 25.94±9.42 10.94±6.35 0.28±0.11 31.96±5.77研究組 19.22±5.16* 52.92±13.85 24.45±12.55 19.48±3.94* 0.63±0.09* 41.33±9.05*輕度哮喘組 10.32±2.61* 41.63±7.03 34.03±8.44 11.45±2.36 0.34±0.11 23.01±5.02中度哮喘組 18.64±3.22*# 67.32±10.28*# 35.83±6.97 18.42±1.84*# 0.59±0.07*# 38.44±5.16*#重度哮喘組 24.98±3.24*#△ 72.35±4.00*# 39.21±2.14 22.38±1.82*# 0.72±0.10*#△ 42.56±7.65*#組別 IL-13/（ng/mL） IL-2/（pg/mL） IL-10/（ng/mL） IFN-γ/（pg/mL） IFN-γ/IL-10 Th1/Th2對照組 114.31±18.94 190.94±21.90 221.35±54.88 32.41±8.29 0.15±0.05 6.78±1.09研究組 140.28±31.85* 139.12±24.82* 170.64±41.20* 49.54±14.63* 0.31±0.09* 3.74±0.83*輕度哮喘組 99.85±13.94 189.43±16.43 220.81±21.39 39.69±7.08 0.17±0.08 4.58±0.45*中度哮喘組 122.85±20.45 140.06±16.53*# 165.34±20.38*# 44.87±7.92*# 0.25±0.11*# 3.62±0.51*#重度哮喘組 148.62±19.35*# 118.63±17.44*# 152.97±19.57*# 51.82±9.15*# 0.33±0.08*#△ 3.01±0.43*#△

2.3 不同治療效果患兒治療前、后誘導(dǎo)痰中炎癥相關(guān)細(xì)胞因子水平比較

研究組患兒治療有效48例（有效組）、無效6例（無效組），總有效率為88.89%（48/54）。分析2組治療前、后炎癥相關(guān)細(xì)胞因子水平，發(fā)現(xiàn)無效組治療后淋巴細(xì)胞百分比、IL-4和IL-13均低于治療前，而IL-2、IL-10、IFN-γ、IFN-γ/IL-10及Th1/Th2高于治療前，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；有效組治療后嗜酸性粒細(xì)胞百分比、淋巴細(xì)胞百分比、IL-4、IL-13、Tim-3 mRNA、IFN-γ、IFN-γ/IL-10均低于治療前，而IL-2、IL-10、Th1/Th2高于治療前，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。治療后，有效組嗜酸性粒細(xì)胞百分比、Tim-3 mRNA、IFN-γ、IFN-γ/IL-10比值低于無效組，而Th1/Th2高于無效組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 不同治療效果患兒治療前、后誘導(dǎo)痰中炎性細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子水平比較 ±s

表2 不同治療效果患兒治療前、后誘導(dǎo)痰中炎性細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子水平比較 ±s

注：與無效組治療后比較，*P＜0.05；與各組治療前比較，#P＜0.05。

組別 例數(shù) 嗜酸性粒細(xì)胞百分比/%中性粒細(xì)胞百分比/%單核細(xì)胞百分比/%淋巴細(xì)胞百分比/% Tim-3 mRNA IL-2/（pg/mL）無效組 6治療前 19.69±4.74 50.55±7.04 23.99±13.11 18.03±4.44 0.70±0.10 141.39±30.55治療后 16.29±5.44# 53.25±10.06 22.83±11.26 13.85±4.13# 0.62±0.09 179.33±49.20#有效組 48治療前 19.01±5.92 51.86±7.96 24.02±12.26 19.48±3.94 0.73±0.09 139.03±29.94治療后 8.02±3.79*# 53.83±9.26 22.30±10.68 12.39±4.13# 0.42±0.11*# 180.63±39.97#組別 IL-4/（pg/mL） IL-10/（ng/L） IL-13/（ng/L） IFN-γ/（pg/mL） IFN-γ/IL-10 Th1/Th2無效組治療前 40.94±10.11 168.54±53.82 139.15±33.78 49.33±15.98 0.32±0.09 3.62±0.96治療后 36.72±9.02# 217.88±49.68# 111.76±30.02# 39.78±16.35# 0.20±0.05# 4.92±1.11#有效組治療前 41.59±9.76 171.39±51.48 141.75±30.96 50.41±14.63 0.34±0.07 3.80±1.07治療后 34.19±9.23# 214.53±43.37# 114.04±29.89# 25.38±15.86*# 0.12±0.04*# 5.67±1.22*#

2.4 誘導(dǎo)痰中炎性細(xì)胞類型、炎癥相關(guān)細(xì)胞因子與兒童哮喘的關(guān)系

以是否出現(xiàn)支氣管哮喘（是為1，否為0）為因變量做Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，嗜酸性粒細(xì)胞百分比[比值比（odds ratio，OR）=2.102，95%可信區(qū)間（cofidence interval，CI）為1.097～7.036，P=0.011]、Tim-3 mRNA（OR=1.936，95%CI為1.227～7.218，P=0.023）、IFN-γ（OR=0.476，95%CI為0.292～0.714，P=0.013）、IL-10（OR=0.357，95%CI為0.261～0.684，P=0.015）、IFN-γ/IL-10（OR=0.444，95%CI為0.352～0.729，P=0.004）及Th1/Th2（OR=0.487，95%CI為0.339～0.859，P=0.009）為兒童支氣管哮喘的影響因素。

2.5 嗜酸性粒細(xì)胞百分比、Tim-3 mRNA、IFN-γ及IFN-γ/IL-10、Th1/Th2對兒童支氣管哮喘與支氣管肺炎（不合并哮喘）的鑒別診斷價值

以是否為支氣管哮喘作為因變量[1為兒童支氣管哮喘，0為支氣管肺炎（不合并哮喘）]，以對照組、研究組之間存在差異的指標(biāo)作為自變量，繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線。ROC曲線分析結(jié)果顯示，嗜酸性粒細(xì)胞百分比、Tim-3 mRNA、IFN-γ、IFN-γ/IL-10、Th1/Th2對兒童支氣管哮喘與支氣管肺炎（不合并哮喘）的鑒別診斷具有一定的價值。見圖1和表3。

圖1 嗜酸性粒細(xì)胞百分比、Tim-3 mRNA、IFN-γ及IFN-γ/IL-10、Th1/Th2診斷兒童支氣管哮喘的ROC曲線

表3 嗜酸性粒細(xì)胞百分比、Tim-3 mRNA、IFN-γ、IFN-γ/IL-10和Th1/Th2鑒別診斷兒童支氣管哮喘的效能

3 討論

兒童支氣管哮喘是由多種炎性細(xì)胞及炎癥相關(guān)細(xì)胞因子共同作用導(dǎo)致的異質(zhì)性呼吸道慢性炎癥性疾病，呼吸道炎癥和呼吸道高反應(yīng)性是該病的基本病理特征[6]。支氣管哮喘的發(fā)生率及病死率不斷上升，嚴(yán)重影響患兒生長發(fā)育及身心健康。誘導(dǎo)痰細(xì)胞學(xué)檢查是氣道炎癥重要標(biāo)志物檢測及疾病治療指導(dǎo)的主要方法，該方法安全、有效、重復(fù)性好、對人體無損害。有研究結(jié)果顯示[7]，誘導(dǎo)痰中嗜酸性粒細(xì)胞不斷增多與哮喘患者激素治療不足或?qū)に刂委煷嬖谀褪艿扔嘘P(guān)；當(dāng)誘導(dǎo)痰中的嗜酸性粒細(xì)胞百分比＞2.5%時，提示存在支氣管炎癥。本研究結(jié)果顯示，無論是兒童支氣管肺炎還是支氣管哮喘，誘導(dǎo)痰中的嗜酸性粒細(xì)胞百分比均＞2.5%，且支氣管哮喘患兒誘導(dǎo)痰中的嗜酸性粒細(xì)胞百分比明顯高于支氣管肺炎患兒。在哮喘急性期發(fā)作患者中，嗜酸性粒細(xì)胞百分比明顯高于非急性期發(fā)作患者，表明嗜酸性粒細(xì)胞水平變化與哮喘發(fā)作存在相關(guān)性[8]。本研究結(jié)果顯示，兒童支氣管哮喘越嚴(yán)重，嗜酸性粒細(xì)胞百分比越高；經(jīng)藥物治療后，嗜酸性粒細(xì)胞百分比下降，提示其可能與支氣管哮喘控制良好存在相關(guān)性。本研究通過Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，嗜酸性粒細(xì)胞百分比為兒童支氣管哮喘的重要參考指標(biāo)，ROC曲線分析結(jié)果顯示，嗜酸性粒細(xì)胞百分比可作為兒童支氣管哮喘與兒童支氣管肺炎（不合并哮喘）鑒別診斷的指標(biāo)，可為臨床進(jìn)一步有效鑒別診斷這2種疾病提供參考依據(jù)，建議臨床進(jìn)一步進(jìn)行多樣本、多中心研究。

淋巴細(xì)胞在多種慢性呼吸道炎癥性疾病中發(fā)揮作用，淋巴細(xì)胞分泌的炎癥因子，如IFN-γ、IL-4、IL-10等在氣道炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[9]，淋巴細(xì)胞又可分為T細(xì)胞、B細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞，每種細(xì)胞類型及其分泌的細(xì)胞因子在氣道炎癥反應(yīng)中的作用不盡相同。本研究結(jié)果顯示，支氣管哮喘患兒淋巴細(xì)胞百分比高于支氣管肺炎（不合并哮喘）患兒。

本研究還發(fā)現(xiàn)，支氣管哮喘患兒誘導(dǎo)痰中IL-2、IFN-γ明顯低于支氣管肺炎（不合并哮喘）患兒；經(jīng)治療后，支氣管哮喘患兒IL-2、IFN-γ水平均顯著高于治療前，提示IL-2、IFN-γ水平可能成為支氣管哮喘重要的療效評估指標(biāo)；支氣管哮喘患兒IL-2、IFN-γ水平明顯低于支氣管肺炎（不合并哮喘）患兒，用ROC曲線進(jìn)一步評價IL-2、IFN-γ在支氣管哮喘與支氣管肺炎（不合并哮喘）鑒別診斷中的作用，結(jié)果顯示IFN-γ對支氣管哮喘與支氣管肺炎（不合并哮喘）的鑒別診斷具有一定的價值。Th1/Th2免疫功能失衡是誘導(dǎo)兒童支氣管哮喘發(fā)病的重要原因[10]，本研究結(jié)果顯示，研究組Th1/Th2低于對照組（P＜0.05），說明支氣管哮喘患兒存在Th1/Th2失衡，與既往研究結(jié)果[11]一致。Th1能分泌IL-2和IFN-γ，機體內(nèi)IFN-γ具有增強巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的抗感染免疫反應(yīng)，對體內(nèi)病原體感染有抑制作用，可增強巨噬細(xì)胞對病原體的殺傷能力[12]，IL-2可與IFN-γ共同作用，對IgE的生成及Th2克隆均具有一定的抑制作用[13]，Th2可分泌IL-4[11]，IL-4可以作用于B細(xì)胞，產(chǎn)生IgE，具有改變B細(xì)胞產(chǎn)生類型，誘發(fā)哮喘[14]。Tim-3優(yōu)先表達(dá)在Th1，其與配體相互作用可負(fù)調(diào)節(jié)Th1介導(dǎo)的免疫應(yīng)答[3]，因而Tim-3可輔助性調(diào)控Th1/Th2的平衡，發(fā)揮免疫調(diào)控功能，其導(dǎo)致的機體免疫炎癥反應(yīng)可引發(fā)哮喘[15]，在變應(yīng)性哮喘患者中存在Th1/Th2的不平衡，且與CD4+T細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)上調(diào)有關(guān)[16]。

本研究結(jié)果顯示，支氣管哮喘患兒Th1/Th2明顯低于支氣管肺炎（不合并哮喘）患兒，ROC曲線分析結(jié)果顯示，Th1/Th2對于兒童支氣管哮喘與支氣管肺炎（不合并哮喘）的鑒別診斷有一定的價值。IL-10是目前公認(rèn)的炎癥與免疫抑制因子[17]，作為淋巴細(xì)胞合成的抑制因子，具有抑制自然殺傷細(xì)胞或者T細(xì)胞活化的作用，其水平下降會導(dǎo)致哮喘加重[18]；IL-13則是被公認(rèn)的一種獨立參與哮喘的有致炎作用的Th2型細(xì)胞因子[19]。本研究結(jié)果顯示，支氣管哮喘患兒誘導(dǎo)痰中Tim-3 mRNA、IL-4、IL-13水平高于支氣管肺炎（不合并哮喘）患兒，而IL-10水平低于支氣管肺炎（不合并哮喘）患兒。Logsitic回歸分析結(jié)果顯示，IL-10、Tim-3 mRNA與支氣管哮喘存在顯著相關(guān)性。ROC曲線分析結(jié)果顯示，Tim-3 mRNA對支氣管哮喘與支氣管肺炎（不合并哮喘）有一定的鑒別作用，提示Tim-3 mRNA作為Th2細(xì)胞因子之一，具有鑒別支氣管哮喘與支氣管肺炎（不合并哮喘）的作用。

促炎性因子主要有IL-12、IFN-γ、IL-17等，而抗炎因子有IL-4、IL-10等。為了研究促炎-抗炎細(xì)胞因子在兒童支氣管哮喘中的作用，本研究對比了IFN-γ/IL-10在兒童支氣管哮喘及支氣管肺炎（不合并哮喘）中的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)治療后支氣管哮喘患兒抗炎因子IL-10水平明顯升高，而IFN-γ、IFN-γ/IL-10水平下降。ROC曲線分析結(jié)果顯示，IFN-γ/IL-10對支氣管哮喘及支氣管肺炎（不合并哮喘）的鑒別診斷有一定的價值。為了進(jìn)一步分析促炎、抗炎因子對治療效果的評價意義，本研究對治療有效和無效患兒進(jìn)行了治療前、后的促炎、抗炎因子水平比較，發(fā)現(xiàn)有效組治療后嗜酸性粒細(xì)胞百分比、Tim-3 mRNA、IFN-γ、IFN-γ/IL-10、Th1/Th2與無效組存在差異，提示上述幾種指標(biāo)對于支氣管哮喘療效評估有一定的價值。

綜上所述，支氣管哮喘患兒誘導(dǎo)痰中炎性細(xì)胞類型及炎癥相關(guān)細(xì)胞因子能較好地鑒別支氣管哮喘和支氣管肺炎（不合并哮喘），嗜酸性粒細(xì)胞百分比、Tim-3 mRNA及IFN-γ對支氣管哮喘療效評估、鑒別診斷具有一定作用，同時誘導(dǎo)痰檢測具有無創(chuàng)、操作方便的優(yōu)勢，有利于兒童接受，值得在臨床中推廣。