陳 懿 李 雪 林文雅 陳金霞 張友才

自噬是發(fā)生在所有真核細胞內(nèi)的一種穩(wěn)態(tài)過程，涉及雙膜自噬體中細胞質(zhì)成分的分離[1，2]。細胞或環(huán)境壓力刺激自噬，通過形成自噬體清除受損的細胞器、蛋白聚集物和細胞內(nèi)的病原體，然后將其作為溶酶體消化的目標[3]。自噬在腫瘤的促進和抑制中起著重要的作用。在腫瘤發(fā)生的早期階段，自噬清除受損的細胞器和DNA，以維持正常的細胞結(jié)構(gòu)和代謝穩(wěn)定性，從而抑制腫瘤的發(fā)展[4]。在腫瘤的晚期，自噬被上調(diào)，并通過從降解的蛋白質(zhì)和細胞器中吸收營養(yǎng)和能量來促進腫瘤細胞的增殖[5]。

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，逐漸成為影響人類健康的公共衛(wèi)生問題[6]。雖然制定了各種監(jiān)測系統(tǒng)和治療策略，包括手術(shù)切除、射頻消融、經(jīng)動脈化療栓塞、系統(tǒng)治療和肝移植等，但由于肝內(nèi)和肝外復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率高，肝癌的預(yù)后仍然很差[7]。臨床上，TNM腫瘤分期、組織學(xué)分級等被用來評估肝癌患者的預(yù)后因素。然而，這些臨床病理特征并不能準確地提供預(yù)測患者預(yù)后的信息。因此，需要開發(fā)可靠、準確的預(yù)后標志物，來幫助臨床醫(yī)生制定治療策略。

自噬在肝癌中的研究得到了越來越多的重視，自噬相關(guān)基因(autophagy-related genes，ARGs)表達影響肝癌的進展[8，9]。有研究報道某些物質(zhì)可通過PI3K-AKT通路，激活自噬，誘導(dǎo)細胞凋亡[10，11]。本研究旨在探究自噬相關(guān)基因在HCC患者中的潛在預(yù)后價值，探究自噬可能涉及的信號通路，并將ARGs表達與患者臨床資料相結(jié)合，分析ARGs表達對肝細胞癌患者預(yù)后的影響。

材料與方法

1．自噬相關(guān)基因：從人類自噬基因數(shù)據(jù)庫(HADb)中獲得了人類232個人類自噬相關(guān)基因(http:∥autophagy.lu/clustering/index.html)。

2．肝癌相關(guān)數(shù)據(jù)集：從TCGA數(shù)據(jù)庫下載377例肝細胞癌患者肝組織的轉(zhuǎn)錄組表達數(shù)據(jù)及相應(yīng)的臨床信息?？偵鏁r間(overall survival, OS)被定義為從診斷到死亡或最后隨訪的間隔時間。

3．差異基因篩選及功能分析:采用Wilcoxon秩檢驗識別差異表達的自噬相關(guān)基因(DEARGs)。對得到的DEARGs進行GO富集及KEGG信號通路分析，并對結(jié)果進行可視化。

4．統(tǒng)計學(xué)方法：所有的統(tǒng)計分析均用R軟件(R3.6.0)進行，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用單因素COX回歸篩選預(yù)后相關(guān)基因，多因素COX分析構(gòu)建預(yù)后模型。在將每個特定基因的表達值合并后，構(gòu)建每個患者的風(fēng)險值公式，并根據(jù)其估計的回歸系數(shù)在多變量COX回歸分析中加權(quán)。根據(jù)風(fēng)險值中位數(shù)將TCGA數(shù)據(jù)集的HCC患者分為高、低風(fēng)險組。采用Kaplan-Meier法對兩組患者的生存差異進行評估，并采用Log-rank統(tǒng)計方法進行比較。采用多因素COX回歸分析和分層分析，探討風(fēng)險值在預(yù)測患者預(yù)后中的作用。ROC曲線下面積(AUC)可作為判斷預(yù)后準確性的指標。

結(jié) 果

1．差異自噬基因的篩選：采用Wilcoxon秩檢驗從374例肝細胞癌組織樣本及50例正常組織樣本的提取差異表達的自噬相關(guān)基因(DEARGs)，共篩選出上調(diào)基因58個，下調(diào)基因4個，差異自噬相關(guān)基因表達，詳見圖1。

圖1 差異的自噬相關(guān)基因在正常組織和腫瘤組織中的表達

2．DEARGs的功能富集:對62個差異表達的ARGs進行功能富集分析，GO富集顯示，基因的生物學(xué)過程主要集中在自噬過程及膜的調(diào)節(jié)。KEGG通路顯示，差異基因的途徑主要集中在自噬、細胞凋亡、PI3K-AKT信號通路，詳見圖2。

圖2 差異表達的自噬相關(guān)基因GO及KEGG富集分析 A.GO富集分析；B.KEGG通路富集分析

3．預(yù)后相關(guān)ARGs的篩選:將62個差異自噬相關(guān)基因進行單因素COX分析，發(fā)現(xiàn)共32個ARGs與肝細胞癌患者整體生存明顯相關(guān)。風(fēng)險比森林圖顯示只有FOXO1基因是保護性基因，詳見圖3。

圖3 預(yù)后相關(guān)的自噬基因風(fēng)險比森林圖

4.ARGs預(yù)后風(fēng)險評分的建立：采用多因素COX回歸篩選出最具有預(yù)后潛力的14個自噬相關(guān)基因(SQSTM1，CASP8，RGS19，ATG10，HSPB8，SPNS1，HSP90AB1，HGS，HDAC1，MLST8，ATIC，BIRC5，F(xiàn)OXO1，RHEB),詳見表1。根據(jù)每個基因的mRNA表達水平和風(fēng)險系數(shù)計算每個患者的風(fēng)險值。根據(jù)以下風(fēng)險值計算公式，風(fēng)險值=(0.232)×SQSTM1+(-0.497)×CASP8+(-0.259)×RGS19+(0.395)×ATG10+(0.149)×HSPB8+(1.598)×SPNS1+(-0.285)×HSP90AB1+(-0.354)×HGS+(0.453)×HDAC1+(-0.747)×MLST8+(0.672)×ATIC+(0.189)×BIRC5+(-0.257)×FOXO1+(0.545)×RHEB，將肝細胞癌患者分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組，Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，高、低風(fēng)險組患者的生存率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，詳見圖4A。

表1 多因素COX回歸構(gòu)建模型基因

5．ARGs的獨立預(yù)后分析及風(fēng)險模型準確性：單因素分析顯示，肝細胞癌患者的分期和風(fēng)險值與OS有關(guān)(P<0.05,圖4B)。此外，根據(jù)臨床病理特征如年齡、性別、腫瘤病理分級、腫瘤分期等進行多因素COX回歸分析結(jié)果表明，風(fēng)險值仍是患者的獨立預(yù)后指標(P<0.05，圖4C)。1年、3年對應(yīng)的受試者工作特征(ROC)曲線下面積分別為0.765和0.732(圖4D、圖4E)。

6．風(fēng)險評分與臨床特征相關(guān)性:將ARGs構(gòu)建的風(fēng)險值與患者臨床特征進行比較，根據(jù)2017版肝癌AJCC分期，Ⅲ～Ⅳ期患者風(fēng)險值較Ⅰ～Ⅱ期患者更高(P<0.05,Z=-2.12)，詳見圖5A。高風(fēng)險組患者腫瘤病理等級較低風(fēng)險組患者更高(圖5B)。

討 論

大量研究報道，自噬與癌癥的發(fā)生密切相關(guān)。有研究表明，自噬相關(guān)基因ATG10在非小細胞肺癌中表達上調(diào)，其高表達是肺癌患者死亡的危險因素[12]。在乳腺癌中，BECN1等位基因缺失通過p53依賴的機制抑制乳腺腫瘤發(fā)生[13]。EIF4G1在鼻咽癌組織及細胞系中高表達，是判斷鼻咽癌患者整體生存的獨立預(yù)后指標[14]。在這項研究中，F(xiàn)OXO1是肝細胞癌的保護基因，過表達FOXO1可改善HCC患者預(yù)后，這與以往的研究一致[15，16]。

生物信息學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，自噬相關(guān)基因富集在凋亡及PI3K-AKT等信號通路上。有研究報道了PI3K信號通路與乳腺腫瘤的發(fā)生及血管生成有關(guān)[17]。乙型肝炎病毒可通過調(diào)節(jié)PI3K-AKT信號通路，增強抗凋亡蛋白cIAP2表達，誘發(fā)肝癌[18]。體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)，同時使用蘆薈素和二甲雙胍可通過PI3K/AKT/mTOR通路抑制HCC的生長和侵襲，誘導(dǎo)其凋亡和自噬，從而增強抗腫瘤作用[19]。

自噬與凋亡之間相互作用，自噬和凋亡分別控制細胞內(nèi)的細胞器和蛋白質(zhì)以及細胞內(nèi)的細胞的更替，許多應(yīng)激途徑依次誘導(dǎo)細胞內(nèi)的自噬和凋亡，自噬可促進或抑制細胞凋亡。近年來研究發(fā)現(xiàn)，細胞凋亡存在多種類型，凋亡、壞死和自噬之間存在重疊[20]。

圖4 HCC患者的預(yù)后分析及風(fēng)險值預(yù)后價值 A.高低風(fēng)險組生存差異；B.單因素COX分析預(yù)后因素；C.多因素COX分析預(yù)后因素； D.HCC患者1年生存率的ROC曲線；E.HCC患者3年生存率的ROC曲線

圖5 風(fēng)險值與患者臨床分期及病理分級相關(guān)性 A.臨床分期；B.病理等級

本研究分析了來自TCGA數(shù)據(jù)庫HCC患者的基因表達數(shù)據(jù)及臨床信息，以確定影響患者整體生存的ARGs。62個DEARGs在腫瘤樣本及正常組織中差異表達，并富集在PI3K-AKT信號通路上。經(jīng)過單因素及多因素COX回歸分析，最終確立了14個預(yù)后相關(guān)的自噬基因納入研究?；谧允傻姆肿犹卣鳎瑯?gòu)建了風(fēng)險模型，K-M曲線分析顯示高風(fēng)險組生存時間較低風(fēng)險組明顯縮短。風(fēng)險值可作為獨立預(yù)后指標，并證明了它們可以為HCC患者提供準確的預(yù)后分析，較腫瘤AJCC分期更為準確。進一步的分析表明，高風(fēng)險組的患者具有更高的TNM分期及更高的病理等級，這證實了隨著風(fēng)險值升高，患者的長期預(yù)后更差。自噬途徑發(fā)現(xiàn)的基因及通路也為臨床上HCC患者的靶向治療提供了新的可能性，但其具體機制仍有待于進一步研究。