曹媛媛 蔡昕添 汪思敏 洪 靜 努爾古麗·買買提 李南方

阻塞性睡眠呼吸暫停(obstructive sleep apnea, OSA)是一種以夜間睡眠打鼾、呼吸暫停和日間嗜睡為特征的睡眠呼吸紊亂疾病，可導致間歇性低氧血癥、高碳酸血癥和睡眠結構紊亂[1]。與OSA相關的主要臨床風險是多器官系統(tǒng)損害，如心腦血管疾病、代謝綜合征和認知功能障礙等[1～3]。OSA在普通人群中的發(fā)生率呈逐年上升趨勢，據(jù)估計，中度至重度OSA在男性中高達49.7%，在女性中高達23.4%[4]。然而，絕大多數(shù)OSA患者(70%～90%)沒有得到及時診治，造成了沉重的健康和社會經(jīng)濟負擔[5]。因此，研究OSA的病因和發(fā)病機制，尋找早期診斷指標和治療靶點至關重要。

據(jù)報道，OSA有較強的遺傳影響，患者一級親屬的風險增加了1.5倍以上[6]。衡量OSA嚴重程度的呼吸暫停低通氣指數(shù)(AHI)中約35%～40%的變異可以用遺傳因素來解釋[7]。目前，基于高通量測序的全基因組DNA微陣列已經(jīng)成為研究復雜疾病遺傳學的一種有效且相對經(jīng)濟的工具[8]。雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些OSA分子標志物，但由于OSA的異質(zhì)性及其復雜的病理生理狀況，單個基因并不能準確地代表OSA的特征[7，9]。與側重于單個基因的差異表達分析不同，共表達網(wǎng)絡分析通過以無監(jiān)督的方式識別協(xié)同表達的基因模塊，為理解疾病的發(fā)病機制和治療干預機會提供了新的見解[10,11]。它已被成功地應用于嚴重哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)及癌癥等多種生物學過程的研究，在識別候選生物學標志物和治療靶點方面被證明是相當有效的[11,12]。

本研究應用加權基因共表達網(wǎng)絡分析(WGCNA)，識別與OSA相關的共表達模塊，對其生物學功能和通路進行注釋；鑒定關鍵模塊中的樞紐基因并深入分析，為尋找與OSA發(fā)病相關的潛在靶基因提供理論依據(jù)。

材料與方法

1.數(shù)據(jù)的獲取：從NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下載OSA的全基因組表達數(shù)據(jù)集GSE135917進行初步分析，該數(shù)據(jù)集基于GPL6244平臺，來源于10例OSA患者和8例正常對照者的皮下脂肪組織樣本，其中包含了每例樣本對應的年齡、性別、體重指數(shù)(BMI)及疾病狀況的臨床信息[13]。另一基于GPL6244平臺的獨立數(shù)據(jù)集GSE38792，包含10例OSA患者和8例正常對照者的內(nèi)臟脂肪組織樣本，用于后續(xù)驗證[14]。

2.數(shù)據(jù)的處理與篩選：應用R語言及其程序包對含有原始數(shù)據(jù)(.CEL文件)進行預處理、歸一化和質(zhì)量控制，采用RMA法進行背景校正、分位數(shù)歸一化和中值拋光。根據(jù)注釋平臺，將探針I(yè)D轉(zhuǎn)換為基因符號。利用Limma包，以經(jīng)典貝葉斯t檢驗進行OSA與正常組之間的差異表達分析，以Benjamini-Hochberg法校正P值為錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)。本研究以|log2Fold Change|≥0.585且FDR<0.05為標準篩選出差異表達基因(DEGs)用于共表達網(wǎng)絡的構建。

3.加權基因共表達網(wǎng)絡的構建：通過R語言中的WGCNA包構建DEGs的共表達網(wǎng)絡[11]。利用hclust函數(shù)進行聚類分析，剔除數(shù)據(jù)集中的離群樣本，利用pickSoftThreshold函數(shù)確定合適的軟閾值(β)，得到擬合指數(shù)R2>0.8的近似無尺度網(wǎng)絡分布。利用blockwiseModules函數(shù)進行一步法網(wǎng)絡構建和模塊檢測，生成最小模塊大小為30，合并切割高度為0.25的共表達基因模塊與拓撲重疊矩陣(TOM)。對每個模塊進行主成分分析，以第一主成分計算基因模塊的特征值(module eigengenes, MEs)。引入上述臨床表型，計算MEs與各臨床表型之間的相關系數(shù)，識別與OSA顯著相關的基因模塊。模塊內(nèi)分析基因表達與表型的相關性(gene significance, GS)、與模塊的相關性(module membership, MM)，以篩選關鍵樞紐基因。

4.關鍵模塊的功能富集分析：選取與OSA顯著相關的基因模塊，利用Cytoscape 3.7.2軟件中ClueGo插件進行基因本體論(GO)注釋、京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路分析(kappa score=0.4,P≤0.01)。利用STRING 11.0數(shù)據(jù)庫進行模塊內(nèi)基因的蛋白-蛋白相互作用(PPI)分析(combined score≥0.7)，利用Cytoscape軟件中cytoHubba插件的Degree法可視化排名前30位的基因(Top30)。

5.關鍵基因的識別與驗證：從關鍵模塊Top30基因構建的PPI網(wǎng)絡中，依據(jù)節(jié)點度值選取排名前3位的基因為關鍵基因。整合GSE135917和GSE38792數(shù)據(jù)集，利用ggpubr、ggplot2包對關鍵基因在OSA和正常組織的表達再次驗證，利用pROC包繪制ROC曲線評估關鍵基因的診斷價值和預測OSA的最佳截斷值。

結 果

1.芯片數(shù)據(jù)的基本信息：經(jīng)過數(shù)據(jù)預處理，從18個組織樣本中共獲得23281個基因表達值。以|log2Fold Change|≥0.585且FDR<0.05為標準，OSA與正常組相比，共篩選到3425個DEGs，其中上調(diào)基因497個，下調(diào)基因2928個。火山圖顯示了DEGs的分布，熱圖顯示了DEGs與樣本的雙向分層聚類結果。為降低噪音及計算機的運行負荷，將3425個DEGs用于下一步共表達網(wǎng)絡的構建(圖1)。

圖1 GSE135917差異基因的篩選 A. 火山圖(紅點表示上調(diào)的差異基因；藍點表示下調(diào)的差異基因；灰點表示無差異的基因)B. 熱圖(紅色表示差異基因的高表 達；藍色表示差異基因的低表達)

2.加權基因共表達網(wǎng)絡的構建：通過WGCNA算法，依據(jù)無尺度網(wǎng)絡分布擬合，選取 β=18作為本數(shù)據(jù)集的軟閾值，并計算基因間的鄰接矩陣與拓撲重疊TOM，基于TOM構建基因間的分層聚類樹，動態(tài)剪切樹法合并MEs相似度較高的模塊，最終把基因聚類成3個模塊,即Turquoise模塊(2345個基因)、Blue模塊(220個基因)、Grey模塊(3個基因)(圖2A)，其中將不能聚類到任何模塊的基因歸于Grey模塊，在后續(xù)分析中將其移除。進一步的共表達模塊與臨床表型的相關性熱圖分析(圖2B)顯示，Turquoise模塊與OSA相關性最強(r=-0.98，P=0.000)，以其作為關鍵模塊進行GS與MM分析，Turquoise模塊內(nèi)基因與臨床表型相關性良好，呈明顯線性相關(圖2C)，分布在右上角的基因既與其他基因關聯(lián)性高又與OSA的發(fā)病有密切聯(lián)系，有助于疾病關鍵基因的識別。因此，筆者用STRING數(shù)據(jù)庫對Turquoise模塊構建蛋白相互作用網(wǎng)絡，并用Cytoscape軟件可視化節(jié)點度最高的前30個基因，結果發(fā)現(xiàn)，該模塊存在多個樞紐基因，如SLC2A2、PRL、SST等(圖2D)。

3.關鍵模塊的功能富集分析：利用Cytoscape中的ClueGo插件對Turquoise模塊內(nèi)基因進行GO和KEGG富集分析，結果以P≤0.01為入選標準。該模塊的基因功能主要注釋于GO:0004984嗅覺受體活性，GO:0043227膜結合細胞器，GO:0005654核質(zhì)，GO:0045184蛋白質(zhì)定位。另外，KEGG通路分析顯示該模塊基因主要富集于嗅覺轉(zhuǎn)導通路(hsa04740)和神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路(hsa04080)(圖3)。

4.關鍵基因的識別與驗證：從Top30基因構建的PPI網(wǎng)絡中，依據(jù)節(jié)點度值選取排名前3位的基因SLC2A2、PRL、SST作為后續(xù)分析與驗證的關鍵基因。筆者整合GSE135917和GSE38792數(shù)據(jù)集的樣本(包括20例OSA組織和16例正常組織)，通過分析各關鍵基因的表達水平發(fā)現(xiàn)，與正常組織比較，SLC2A2、PRL、SST在OSA組織中的表達明顯降低(P均<0.01)，與芯片分析結果一致(圖4A)。隨后，進行ROC分析以確定3個關鍵基因的診斷價值及在基因表達水平預測OSA的最佳截斷值(圖4B，表1)，結果提示這3個關鍵基因很可能與OSA的發(fā)生、發(fā)展有重要聯(lián)系。

圖2 加權基因共表達網(wǎng)絡的構建 A.分層聚類樹與共表達模塊;B.模塊與臨床表型的相關性熱圖;C.Turquoise模塊內(nèi)基因與臨床表型數(shù)據(jù)關聯(lián)性; D.Turquoise模塊內(nèi)節(jié)點度最高的30個基因構建的蛋白相互作用網(wǎng)絡圖

圖3 Turquoise模塊的功能富集分析 A.GO富集分析;B.KEGG信號通路分析

圖4 關鍵基因的驗證 A.GSE135917與GSE38792中關鍵基因的表達水平;B.關鍵基因的ROC曲線

表1 關鍵基因的ROC曲線分析

討 論

OSA發(fā)病機制復雜，涉及多個器官系統(tǒng)的病理生理變化[2]。既往研究多數(shù)從單個基因出發(fā)，僅能對生物學過程做出局部解釋，WGCNA通過構建基因間的鄰接矩陣、拓撲重疊TOM，識別高度協(xié)同變化的基因模塊，并能結合臨床信息，分析模塊與臨床表型的相關性，充分利用基因組大數(shù)據(jù)信息，對其進行整體全面探索[11]。本研究利用WGCNA法篩選與OSA顯著相關的基因模塊，并對模塊內(nèi)基因進行功能富集分析，這些基因主要與嗅覺轉(zhuǎn)導、神經(jīng)活性配體-受體相互作用等密切相關。隨后對關鍵模塊構建蛋白相互作用網(wǎng)絡，將樞紐基因可視化后識別出3個關鍵基因，通過在另一張芯片上再次驗證，發(fā)現(xiàn)SLC2A2、PRL、SST在OSA組織中表達均下調(diào)，進一步的ROC曲線分析顯示這3個關鍵基因可能是OSA潛在的生物學標志物。目前3個基因在OSA中尚未有相關報道，但仍有證據(jù)提示它們與OSA存在潛在關聯(lián)。

SLC2A2是溶質(zhì)載體家族2成員，編碼葡萄糖轉(zhuǎn)運子樣蛋白GLUT2，分布于肝、腎、腸、胰島β細胞和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，促進葡萄糖在質(zhì)膜上的被動轉(zhuǎn)運，在控制機體葡萄糖穩(wěn)態(tài)中起重要作用[15]。在芬蘭糖尿病預防研究中，SLC2A2的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)與糖耐量受損向2型糖尿病的轉(zhuǎn)化相關，而且這種關聯(lián)與體重變化無關[16]。Borglykke等[17]在評估46個2型糖尿病相關基因變異的單獨效應和累積效應時發(fā)現(xiàn)，只有SCL2A2的小等位基因與心血管事件發(fā)生風險增加顯著相關，而且這種關聯(lián)與基線糖尿病狀態(tài)無關。本研究結果表明，SLC2A2在OSA患者中的表達水平降低，且具有良好的識別能力(AUC=0.9594)。目前OSA對心血管疾病、代謝綜合征和神經(jīng)精神障礙的不利影響日益受到關注，一些基因變異參與OSA發(fā)病機制，且可能與OSA相關疾病的發(fā)生也存在因果關系[7]。因此，研究SLC2A2變異是否同時與OSA和共病疾病(如糖尿病、心血管疾病)相關，即SLC2A2變異可能通過不同的機制同時影響這兩種表型，可能具有重要意義。

催乳素(PRL)是一種由腦垂體分泌的蛋白質(zhì)激素，參與泌乳、生殖、血管生成、免疫反應和滲透調(diào)節(jié)等多種生物學過程[18]。PRL還可影響睡眠結構，PRL基因缺陷小鼠的快速眼動睡眠比野生型小鼠減少[19]。此外，在高催乳素血癥患者中觀察到代謝改變、體重易增加，這些患者在其催乳素正?；篌w重可減輕[20]。PRL可通過調(diào)節(jié)LPL活性和脂肪生成，減少脂聯(lián)素在人體脂肪組織中的釋放來調(diào)節(jié)能量代謝[21]。在一項針對早發(fā)和病態(tài)肥胖的全基因組關聯(lián)研究(GWAS)中發(fā)現(xiàn)，PRL基因附近的變異與常見肥胖和BMI變異相關[22]。Nilsson等[21]在芬蘭西部的一項大規(guī)模人群研究中成功復制了這種關聯(lián)，發(fā)現(xiàn)PRL基因附近的變異與男性肥胖的增加有關。本研究中，與正常組織比較，OSA患者PRL基因的表達顯著降低。眾所周知，肥胖使OSA的發(fā)病風險增加10～14倍，有望解釋高達40%的AHI變異，鑒定決定“中間表型”的基因可能有助于識別OSA的易感基因[7]。因此，有必要進一步研究PRL變異是否通過睡眠結構改變或中間表型(如肥胖)導致OSA。

生長抑素(SST)是一種環(huán)肽激素，影響生長激素的釋放和胃腸功能。SST可通過調(diào)節(jié)胃腸運動、腸道養(yǎng)分吸收和能量平衡來影響機體生長和體重[23]。此外，作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在的神經(jīng)遞質(zhì)或調(diào)質(zhì)，SST在突觸可塑性和神經(jīng)元活性的微調(diào)中發(fā)揮作用[24]。研究表明，SST+/nNOS+神經(jīng)元功能障礙可能導致與慢波活動產(chǎn)生障礙和認知受損相關的病理生理變化，包括阿爾茨海默病(AD)、癲癇、精神分裂癥和創(chuàng)傷性腦損傷等[25]。衰老早期大腦中SST表達下調(diào)導致腦啡肽酶活性逐漸下降，導致AD患者Aβ-淀粉樣蛋白的沉積，因此，SST基因變異可能改變生長抑素的表達或功能，從而參與AD的發(fā)病過程[26]。本研究中SST在OSA樣本中的表達降低，如上所述，OSA與心腦血管病、神經(jīng)精神障礙等密切相關，一些基因變異與OSA和相關疾病的發(fā)生可能均存在因果關系，故SST變異是否會通過不同的機制效應同時導致OSA和認知功能障礙，有必要進一步驗證。

綜上所述，本研究通過WGCNA方法在OSA患者皮下脂肪組織中發(fā)現(xiàn)了2個共表達模塊和3個關鍵基因，有助于為OSA和相關疾病的研究及其診斷治療、靶點選擇提供新的線索。但關鍵基因在OSA發(fā)生中的具體作用，仍需要開展進一步的體內(nèi)、體外實驗予以深入探討。